植物细胞培养

植物细胞培养1第1页，课件共38页，创作于2023年2月本章主要内容第6章细胞培养单细胞培养细胞悬浮培养2第2页，课件共38页，创作于2023年2月1、掌握得到单细胞无性系的技术2、掌握细胞培养的方法，其含义及特点3、学会小细胞团的计数方法4、了解影响单细胞培养的因子5、掌握细胞悬浮培养的方法：成批培养；连续培养。6、理解细胞悬浮培养的应用第6章细胞培养本章教学目的与要求3第3页，课件共38页，创作于2023年2月Haberlandt：观点：首次进行离体细胞培养高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞第6章细胞培养4第4页，课件共38页，创作于2023年2月第一节单细胞培养一、单细胞的分离分离的单细胞看护培养微室培养平板培养单细胞无性系第6章细胞培养5第5页，课件共38页，创作于2023年2月制备单细胞:愈伤组织或悬浮培养物(常);用纤维素酶和果胶酸酶从组织分离6第6页，课件共38页，创作于2023年2月由组织器官经愈伤组织分离单细胞步骤：1）诱导产生愈伤组织；2）愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织松散性；第一节单细胞培养茎段7第7页，课件共38页，创作于2023年2月悬浮振荡培养3）将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。第一节单细胞培养8第8页，课件共38页，创作于2023年2月二、单细胞培养方法（Singlecellculture）第一节单细胞培养9第9页，课件共38页，创作于2023年2月单细胞培养常用的方法：第一节单细胞培养单细胞培养方法看护培养法微室培养法固体平板培养法液体浅层培养法10第10页，课件共38页，创作于2023年2月（一）、看护培养法（Nurseculture）用途：诱导形成单细胞系。第一节单细胞培养含义：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。1看护培养的含义及用途11第11页，课件共38页，创作于2023年2月看护培养图示：NursecallusFilterpaperSinglecell单细胞无性系恒温培养1个月2~3月用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖。这个愈伤组织块称为看护愈伤组织第一节单细胞培养12第12页，课件共38页，创作于2023年2月2看护培养基本技术（1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。（2）在无菌条件下，将一小块（1cm3）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm²）已灭菌的滤纸，放置一晚上。（3）将分离的单细胞接种到培养基的滤纸上。（4）恒温培养。第一节单细胞培养13第13页，课件共38页，创作于2023年2月优点：

（1）简便易行。

（2）效果好，易于成功。

缺点：

（1）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。第一节单细胞培养3、看护培养特点：14第14页，课件共38页，创作于2023年2月1微室培养的含义及用途用途:主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程。（二）、微室培养法（Microculture）第一节单细胞培养含义:将单细胞培养在少量的培养基中。15第15页，课件共38页，创作于2023年2月微室培养图示：1滴含单细胞培养液周围加石蜡油凹穴载玻片旁边加石蜡油盖盖玻片盖盖玻片平视图置培养皿中26~28℃恒温培养第一节单细胞培养16第16页，课件共38页，创作于2023年2月第一节单细胞培养2微室培养特点：优点：

（1）在培养过程中，可以连续进行显微观察一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程

缺点：

（1）培养时间较短17第17页，课件共38页，创作于2023年2月（三）、平板培养法（PlanteCulture）1含义及用途：第一节单细胞培养含义:将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养法。用途:分离单细胞无性系，研究其生理、生化、遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。18第18页，课件共38页，创作于2023年2月2特点第一节单细胞培养固体平板培养图示：优点：

（1）可以定点观察；

（2）分离单细胞系容易；

缺点：

（1）培养细胞气体交换不畅。19第19页，课件共38页，创作于2023年2月

(1)、悬浮细胞密度的调制

平板培养要求最初细胞密度（即初始植板密度）为1×10³-100×10³个/ml

。第一节单细胞培养3平板培养的基本技术初始植板密度：单细胞固体平板培养时，细胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度20第20页，课件共38页，创作于2023年2月1.4%琼脂基本培养基+等量细胞培养液=0.7%琼脂条件培养基。条件培养基：曾悬浮培养过一段时间组织或细胞的液体培养基。第一节单细胞培养（2）培养基配制21第21页，课件共38页，创作于2023年2月第一节单细胞培养植板效率（或植板率）：已形成细胞团的百分数（即每100个铺在平板上的细胞中有多少个能长出细胞团）。

(4)培养：

26℃置暗处培养21天。低倍显微镜观察，记数单细胞或小细胞团，计算置板效率（也称植板率）。（3）制平板：细胞悬浮液与融化状态（35℃）条件培养基按一定比例均匀混合，倒成平板。22第22页，课件共38页，创作于2023年2月小细胞团计数方法：第一节单细胞培养2）细胞团显影法1）低倍显微镜直接计算；23第23页，课件共38页，创作于2023年2月1、条件培养基2、细胞密度(>临界密度)3、生长激素4、pH5、CO2三、影响单细胞培养的因子第一节单细胞培养24第24页，课件共38页，创作于2023年2月第二节、细胞悬浮培养

Suspensionculture含义及特点2、特点

1）细胞可不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；

2）能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。第6章细胞培养1、含义：将离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养25第25页，课件共38页，创作于2023年2月一、悬浮培养类型和方法第二节细胞悬浮培养成批培养连续培养26第26页，课件共38页，创作于2023年2月（一）、成批培养/分批培养（Batchculture）含义：将愈伤组织培养在一定容积的密闭容器中进行培养。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。第二节细胞悬浮培养27第27页，课件共38页，创作于2023年2月1、成批培养特点

第二节细胞悬浮培养（1）培养基体积固定；

（2）必须适当搅拌；

（3）培养过程中，细胞生长，其数目不断发生变化，呈S增长；

（4）但要进行下一批培养，则生长一定时间后，需要继代转移。28第28页，课件共38页，创作于2023年2月培养时间培养细胞数目12345延迟期对数生长期直线生长期缓慢期静止期12345第二节细胞悬浮培养细胞生长曲线29第29页，课件共38页，创作于2023年2月2、成批培养的方法(1)旋转培养(2)往返震荡培养(3)旋转震荡培养(4)搅动培养第二节细胞悬浮培养30第30页，课件共38页，创作于2023年2月（二）、连续培养（Continuousculture）含义：指在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持其恒定体积的培养。第二节细胞悬浮培养31第31页，课件共38页，创作于2023年2月1、连续培养的特点：（1）新鲜培养基的不断加入,保证了养分的充分供应；

（2）可使细胞保持在增殖旺盛的对数生长期中；

（3）适于大规模工业化生产第二节细胞悬浮培养32第32页，课件共38页，创作于2023年2月(1)半连续培养：每隔一定时间倒出一定量的悬浮液，同时补充加入等量的新鲜培养液(2)连续培养：

封闭式和开放式第二节细胞悬浮培养2、连续培养的种类：Productionofanthocyanin33第33页，课件共38页，创作于2023年2月加入培养基排出培养基及其培养物第二节细胞悬浮培养连续培养图示：34第34页，课件共38页，创作于2023年2月三、细胞悬浮培养主要应用1、植物有用物质的生产2、诱发和筛选突变体3、原生质体培养和细胞分离4、食品生产。第二节细胞悬浮培养35第35页，课件共38页，创作于2023年2月1、单细胞的分离方法:1)愈伤组织诱导;2)单细胞悬浮液的制备2、单细胞培养的方法:（1）、看护培养法;(2)微室培养法;(3)平板培养法3、平板培养的基本技术（1）单细胞悬浮液的制备

(2)悬浮细胞密度的调制（3）琼脂培养基配制:0.7%琼脂条件培养基。（4）平板制作（5)培养第6章细胞培养本章小结：36第36页，课件共38页，创作于2023年2月4、影响单细胞培养的因子:1)条件培养基;2)初始细胞植板密度(>临界密度);3)生长物质;4)pH;5)CO25、细胞悬浮培养方法：成批培养；连续培养。6、成批培养的方法