生化生物技术1课件

生化生物技术王旭东.前言二十一世纪----------生命科学的时代5年内国家对生命技术的投入将超过100亿元医学的发展.生化生物实验技术发展简史20年代：微量分析技术导致了维生素、激素和辅酶等的发现。瑞典著名的化学家T.Svedberg奠基了“超离心技术的理论基础，1924年制成了第一台5000RCF的离心机（5000r/min-8000r/min，相对离心力“RCF”的单位可表示为“×g”)，并准确测定了血红蛋白等复杂蛋白质的分子量，获得了1926年的诺贝尔化学奖。。.离心机.超速离心机.30年代：

电子显微镜技术打开了微观世界，使我们能够看到细胞内的结构和某些生物大分子的大致结构。美国哈佛大学的Folin教授和中国的吴宪教授建立了不少生物化学常用的分析方法如血糖分析、蛋白质含量分析、氨基酸测定等。英藉德裔生物化学家Krebs，在1937年发现了三羧酸循环，对细胞代谢及分子生物学的研究作出了重要贡献，他与美藉德裔生物化学家Lipmann共获1953年诺贝尔生理医学奖。.电子显微镜..40年代：两位英国科学家Martin和Synge发明了分配色谱（层析），他们获得了1952年的诺贝尔化学奖。由此，层析技术成为分离生化物质的关键技术。

电泳技术由瑞典的著名科学家Tisellius奠基，从而开创了电泳技术的新时代，他因此获得了1948年的诺贝尔化学奖。层析技术和电泳技术用于分析生物大分子的组成和代谢的中间产物，示踪技术的应用推动了代谢的研究。美国化学家Pauling确认氢键在蛋白质空间结构中以及生物大分子间相互作用的重要性等，并因此而获得了诺贝尔化学奖。.50年代：自1935年Schoenheimer和Rittenberg首次将放射性同位素示踪用于碳水化合物及类脂物质的中间代谢的研究以后，射性同位素示踪技术50年代有了大的发展，为各种生物化学代谢过程的阐明起了决定性的作用。1953年美国科学家Watson和英国科学家Crick提出DNA分子反向平行双螺旋模型，1962年与英国科学家Wilkins分享诺贝尔生理医学奖，Wilkins和Franklin通过对DNA分子的X-射线衍射研究为Watson和Crick的DNA模型提供了有力的实验证据，DNA双螺旋模型的提出开创了生物科学的历史新纪元。.DNA模型.Watson和Crick.在X-射线衍射技术方面，英国物理学家Perutz对血红蛋白的结构进行X-射线结构分析,Kendrew测定了肌红蛋白的结构，成为研究生物大分子立体结构的先驱，他们同获1962年诺贝尔化学奖。英国生物化学家Sanger还于1953年确定了牛胰岛素中氨基酸的顺序而获得1958年的诺贝尔化学奖。Kornberg发现了DNA聚合酶Ⅰ，美藉西班牙裔科学家Uchoa发现了细菌的多核苷酸磷酸化酶，研究并重建了将基因内的遗传信息通过RNA中间体翻译成蛋白质的过程。两人分享了1959年诺贝尔生理医学奖。.60年代：各种仪器分析方法用于生物化学研究，取得了很大的发展，如HPLC技术、红外、紫外、圆二色等光谱技术、NMR核磁共振技术等。自1958年Stem，Moore和Spackman设计出氨基酸自动分析仪，大大加快了蛋白质的分析工作。1967年Edman和Begg制成了氨基酸序列分析仪，到1973年Moore和Stein设计出氨基酸序列自动分析仪，又大大加快了对多肽一级结构的测定，十多年间氨基酸的自动测定工作得到了很大的发展和完善。.在60年代，层析和电泳技术又有了重大的进展，在1968-1972年Anfinsen创建了亲和层析技术，开辟了层析技术的新领域。1969年Weber应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定了蛋白质的相对分子质量，使电泳技术取得了重大进展。美国生物化学家Nirenberg在破译遗传密码方面作出了重要贡献，Holly阐明了酵母丙氨酸tRNA的核苷酸排列顺序，后来证明所有tRNA的结构均相似。美藉印度裔生物化学家Khorana提出按预定的序列合成核酸分子的方法。他们3人共获1969年诺贝尔生理医学奖。法国生物学家Lwoff、JAcob和生物化学家Monod由于在病毒DNA和mRNA等方面出色的大量研究工作而共获1965年诺贝尔生理医学奖。.70年代：

基因工程技术取得了突破性的进展，Arber，Smith和Nathans三个小组发现并纯化了限制性内切酶，1972年，美国斯坦福大学的Berg等人首次用限制性内切酶切割了DNA分子，并实现了DNA分子的重组。1973年，又由美国斯坦福大学的Cohen等人第一次完成了DNA重组体的转化技术，这一年被定为基因工程的诞生年，Cohen成为基因工程的创始人，从此，生物化学进入了一个新的大发展时期。与此同时，各种仪器分析手段进一步发展，制成了DNA序列测定仪、DNA合成仪等。

.80年代基因工程技术进入辉煌发展的时期，1980年，英国剑桥大学的生物化学家Sanger和美国哈佛大学的Gilbert分别设计出两种测定DNA核苷酸序列的方法，而与Berg共获诺贝尔化学奖，从此，DNA序列分析法成为生物化学与分子生物学最重要的研究手段之一。他们3人在DNA重组和RNA结构研究方面都作出了杰出的贡献。1981年由Jorgenson和Lukacs首先提出的高效毛细管电泳技术（HPCE），由于其高效、快速、经济，尤其适用于生物大分子的分析，因此受到生命科学、医学和化学等学科的科学工作者的极大重视，发展极为迅速，是生化实验技术和仪器分析领域的重大突破，意义深远。现今，由于HPCE技术的异军突起，HPLC技术的发展重点己转到制备和下游技术。.1984年德国科学家Kohler、美国科学家Milstein和丹麦科学家Jerne由于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而共享了诺贝尔生理医学奖。1985年美国加利福尼亚州Cetus公司的Mullis等发明了用PCR技术（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应扩增DNA的技术，对于生物化学和分子生物学的研究工作具有划时代的意义，因而与第一个设计基因定点突变的Smith共享1993年的诺贝尔化学奖1988年，美国遗传学家McClintock由于在二十世纪五十年代提出并发现了可移动的遗传因子而获得诺贝尔生理医学奖。1989年，美国科学家Altman和Cech由于发现某些RNA具有酶的功能（称为核酶）而共享诺贝尔化学奖。.PCR技术.90年代：1993年，美国科学家Roberts和Sharp由于在断裂基因方面的工作而荣获诺贝尔生理医学奖。1994年，美国科学家Gilman和Rodbell由于发现了G蛋白在细胞内信息传导中的作用而分享诺贝尔生理医学奖。1995年，美国科学家Lewis、德国科学家Nusslein-Volhard和美国科学家Wieschaus由于在20世纪40-70年代先后独立鉴定了控制果蝇体节发育基因而共享诺贝尔生理医学奖。进入21世纪以来，PCR技术、生物芯片技术不断完善，基因组学、蛋白质组学、生物信息学发展迅速。.我国生物化学界的主要成就我国生物化学界的先驱吴宪教授在20年代初由美回国后，在协和医科大学生化系与汪猷、张昌颖等人一道完成了蛋白质变性理论、血液生化检测和免疫化学等一系列有重大影响的研究。1965年我国化学和生物化学家用化学方法在世界上首次人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，1983年又通过大协作完成了酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工合成。近年来，在酶学研究、蛋白质结构及生物膜的结构与功能等方面都有举世瞩目的研究成果。90年代以来，我国参与了人类基因组计划，在水稻基因组研究中处于国际领先水平，在功能基因组学研究中取得不少成绩。.结晶牛胰岛素.第一节蛋白质纯化的基本知识.一、蛋白质纯化的设计（一）基本原则1.原则纯化蛋白质通常是为了获得纯蛋白质以便深人研究蛋白质的活性、结构、结构与功能之间的关系。.首先，必须了解待纯化样品中目的蛋白及主要杂质的性质，尽可能多收集有关蛋白质的来源、性质（分子大小、等电点）和稳定性（蛋白质对温度、极端pH、蛋白酶、氧和金属离子等的耐受性）等信息，这有助于设计蛋白质纯化。.比如目的蛋白是糖蛋白或脂蛋白，它们就明显区别于大多数的杂蛋白；蛋白质是细胞内还是细胞外，可溶还是不可溶等都将影响到蛋白质提取方法和缓冲液组成，对于细胞外蛋白质，除去细胞可以有助于纯化过程，与膜结合的蛋白质需要用有机溶剂先溶解。.其次，纯化开始之前必须了解最终产品的用途，从而设计蛋白质纯化过程，同时要综合考虑纯化产品的质量、数量和经济性等三个方面的要求。纯化后的蛋白质纯度要多高，纯化过程中能允许损失多少活性以及纯化过程需多少时间和成本等都受到目的蛋白用途的影响。目的蛋白纯度如果要求越高，往往所需要的操作时间越长，成本越高。

.最后，充分了解各分离纯化技术操作单元的大量信息也很重要，比如在细胞破碎时，需要了解包括流速、搅拌器类型、操作压力、细胞浓度和种类、产品释放的碎片和大小等；设计分析吸附色谱时，要了解包括色谱柱特征、凝胶或其他吸附剂的性能（结合能力、解离常数、流速等）。.2蛋白质的纯度对目的蛋白纯度的要求取决于纯蛋白质的用途，如果是工业化应用（在食品工业或日用化学工业），则需要大量的产品，此时纯度是次要的。如果纯蛋白质被用于研究，所需数量比较少，在酶学研究中，80％～90％的纯度就足够了，蛋白质结构研究中，纯度要在95％以上，而用于医疗的蛋白质，必须考虑到所有的杂质，对最终产物必须分析污染蛋白质、DNA和在纯化过程中的添加物。.可以采取一些特别的步骤除去这些杂质，但是额外的纯化步骤虽然可以提高纯度，却由于除掉最终的百分之几杂质比最初的纯化要困难得多，会导致收率下降，增加成本，延长了操作时间。为应用于研究而纯化蛋白质，规模小，额外的纯化步骤所需要的花费并不重要，但工业化纯化蛋白质则需要综合考虑纯化的经济性..3蛋白质活性的保持在大多数情况下，纯化后蛋白质应尽可能保持活性，要采取尽可能少的纯化步骤以减少蛋白质变性和蛋白质水解。尽量避免比较粗放的条件（如极端pH、有机溶剂等），选用合适的缓冲液，在纯化的整个过程中，需要控制pH，以减少蛋白质变性，通常采用20～50mmol／L的缓冲液浓度。.蛋白质样品的贮存温度宜在4℃或更低，如果贮存时间长或蛋白质易水解，可采用冷冻方法，用液氮、干冰或甲醇进行快速冷冻比较好，但是冷冻法对有些酶也不适用。在低温（4℃）操作，加快纯化过程而缩短操作时间，或加人蛋白酶抑制剂，都可以降低蛋白质水解程度。.溶酶体是蛋白酶主要来源，尽量避免其受到破坏而释放出蛋白酶，在酶提取液中加人蔗糖或麦芽糖可降低破坏程度。然而，即使是微量蛋白酶，也能水解大量蛋白质，因此在纯化后期也要仔细操作。由于许多蛋白酶分子量在20000～30000之间，凝胶过滤可用于蛋白质初步纯化，以分离大多数蛋白酶污染物。选择简单、快速、高专一性的酶分析方法，可以缩短样品在纯化各步骤间的贮存时间，也可降低蛋白质水解程度。.4蛋白质的数量纯蛋白质的数量不仅仅受原材料数量的影响，还受到蛋白质纯化收率的影响。在有不同原料可供选择时，一般选用目的蛋白最稳定、含量最丰富的，同时也考虑获得原料是否容易，数量是否足够多，成本是否比较低。在纯化过程，每一步骤中都会损失蛋白质，所以纯化步骤应尽量少，以得到高蛋白质收率，但是纯化步骤的减少会降低目的蛋白的最终纯度，需要恰当选择各种纯化方法以提高蛋白质收率。.（二）过程优化蛋白质纯化的过程优化就是使蛋白质纯化后收率、纯度最高，成本最低。在有纯化方案可供实施时，需要对纯化过程进行优化，此时已经了解了纯化过程条件和目的蛋白产品的特性。过程优化必须解决两类问题：一是在可替换的操作中作出选择（如离心或超滤等）；二是设计理想的色谱顺序，以最少的步骤（—、二或三步）获得最大的产量。.每一分离纯化方法都要讽估其处理样品能力、蛋白质收率和纯化成本。在纯化初期阶段，高处理量和低成本十分重要，而在后期高分辨率很重要。纯化分离初期要求减小样品体积，常常使用高处理量的沉淀技术，色谱中吸附法处理量最大，一般不采用凝胶过滤作为纯化初期操作步骤，因为它处理量小。.使用高分辨率技术可以减少纯化步骤，也使蛋白质更纯。沉淀步骤分辨率低，而色谱法高，亲和色谱有很高分辨率。各纯化技术都有一个平均收率范围，硫酸铁沉淀法和双水相提取法的收率通常大于80％。亲和色谱法收率较低（在60％以下），且成本高，因此一般用在纯化的后期。通常先用低成本技术以除去大部分杂质，避免损坏价格高的色谱柱。.纯化技术颇序的选择上，一般先使用沉淀技术，然后依次是离子交换、亲和色谱，最后是凝胶过滤，这样，每一种技术利用了蛋白质的不同性质，沉淀技术能处理大量的高浓度蛋白质溶液，离子交换除去大部分杂蛋白以便进人价格高的亲和色谱柱，凝胶过滤用于最后纯化环节，这时处理量已不是问题。总之，纯化方案的确定，除考虑利用蛋白质不同的特性外，步骤应尽可能少，尽量使分离产物不需进一步处理就可以直接进行下一步操作。.对所有蛋白质适用的纯化方案是不存在的，因为原料来源和各种蛋白质纯化的要求不同。可以通过试用多种方法先找出大致途径，或使用专家系统，以计算机为基础的专家系统在人工智能领域已经成了非常重要的工具，现有的人工智能可以通过相互作用的逻辑推理来找出蛋白质纯化的最理想方案。对100种纯化过程进行分析，平均分离纯化步骤是四步，总收率28％，平均每一步纯化倍数为8。.（三）经济性.（四）规模化蛋白质纯化商业化的多肽和蛋白质生产至今还仅仅限于一些由微生物产生的或是从动植物组织中提取出的酶。重组DNA和组织培养技术的进展使得规模化生产蛋白质和多肽成为可能，其中不少产品都是和人类健康有关的，比如干扰素、抗生素和疫苗等。

.规模化纯化蛋白质，目的是尽可能提高产量，并降低成本，同时也尽可能避免人为因素干扰，纯化过程还应尽可能精简。进行规模化纯化蛋白质时，已经基本了解目的蛋白、原料、生产方法、产品纯度要求和最终数量等，但是纯化过程中很多方面可能要重新评估并作出适当的改变。从实验室规模纯化蛋白质向工业化规模纯化生产蛋白质的扩大，属于工程学的范畴。工厂规模是一次性的，它必须成功。.二、生物分离纯化的一般工艺过程.主要操作过程（一）细胞分离分离微生物细胞的主要措施为离心、传统过滤和膜过滤。传统过滤用于生物悬浮物的分离是困难的，选择离心或膜过滤，需要综合考虑资金、操作维修费用、回收率和过程时间等因素。影响分离过程经济效益的一个主要因素是被分离颗粒的大小。.工业用离心机通常设计成连续进料。细胞在离心机中沉淀越快，在转子中的保留时间就越短，相应地，离心处理量越大。决定离心机容量的一个主要因素是相关粒子的大小。通过离心操作回收酵母已有很多年，而动物细胞的处理更加复杂，因为它们很容易破裂，当通过离心系统时，可能会分解产生微小的碎片。大规模分离细菌和细胞碎片最常用的离心机是多层转盘离心机。在低流速（300～500L／h）时，可以将零。0.5um以上的颗粒分离，而在高流速（3000～5000L／h）时，可以将整个细胞分离出来。但是，离心操作费用高，也难于无菌操作，产生热量，形成噪声。.过滤技术（深层过滤，微孔过滤，超滤）常用于固液分离。旋转式真空过滤机是比较常见的一种，已应用于大规模生产酶制剂过程，从发酵液中除去细菌菌体或丝状微生物。膜过滤系统越来越多应用于规模化从发酵液中分离细胞和细胞碎片，在无菌分离的效果方面远好于价格昂贵的离心机。然而，膜过滤的主要缺点是不能处理高浓度细胞，高浓度细胞会明显降低过滤速度。微滤能够截留溶液中非蛋白质的微小物质，而超滤能够截留溶液中的蛋白质。.（二）细胞破碎和碎片分离对于细胞内蛋白质的分离，需要先有效破碎细胞。通常先收集细胞，然后进行洗涤以除去残留的培养基，对于仅仅由细胞膜包围着的细胞，比如哺乳动物细胞，破碎比较容易，如果存在聚合细胞壁结构（比如微生物细胞），破碎时就会困难些。.实验室中常用的超声波法由于较难以将足够能量输送到大量体积的细胞悬浮液中，不适于大规模破碎。适用于规模化操作的细胞破碎方法主要有均质法和高速玻璃珠研磨法，需要注意的是，应尽量缩短操作时间。均质法是当前最广泛使用的破碎技术，产量可达6000L／h，但它不太适用于高等真菌。装置如果没有制冷，由于释放大量的机械能，温度上升比较高，有些蛋白质会因此而变性，所以样品溶液在进入设备前及离开设备后都要尽量冷却。..研磨法采用无铅玻璃珠（0。4～1。5mm），细胞悬浮液在有小玻璃珠的情况下高速搅拌，最大处理量可以达到2000L／h。最佳玻璃珠尺寸的选择取决于破碎对象的大小和所释放产物所处的位置，小的玻璃珠对破碎细菌非常有效，而大的玻璃珠对酵母细胞很有效。该法的破碎效率受破碎对象、细胞浓度、搅拌速度、玻璃珠大小、温度和进料速度等因素的影响，细胞破碎效率随搅拌速度增加而达到一最高值，然后随速度增加而下降。.相对于均质法，在搅拌速度不高时，细胞浓度会影响到研磨法的破碎效率。最合适的细胞浓度随微生物种类不同而变化，一般为细胞湿重的30％～60％。操作温度通常限制在很窄的范围内，通常在5～15℃，以免造成蛋白质热变性，一般需要采用夹套方式进行冷却。.由于细胞要彻底破碎以获得较高的收率，细胞内所有物质都被释放，因此，必须从复杂混合物（包括蛋白质、核酸及细胞壁碎片）中分离出目的产物，目的蛋白可能会受到释放出的蛋白酶的降解。另外，核酸不仅难以分离，而且大大提高了悬浮液的黏度。除去核酸的技术包括使用核酸酶和沉淀。核酸污染虽然含量很低，但是对于医药级蛋白质还是有影响。.酶解法条件温和，对降解细胞壁结构有特异性，是比较理想的方法。但是不同细胞组织需要不同的酶，而且因所处的不同生理状态，细胞对酶解的敏感程度会有明显变化，因而酶解法还没有被广泛用于规模化破碎微生物细胞，但对于价值较高、采用机械法会造成损失的产品，酶解法已经显示出了良好的应用前景。.细胞破碎过程中产生的细胞碎片，必须除去，以免污染或者堵塞纯化蛋白质所用的色谱柱，可以先进行絮凝，再通过离心法将其碎片分离出来，但对直径小于0.5um颗粒的处理效果不太理想。双水相提取法也常用于分离碎细胞和细胞碎片。.（三）浓缩早期纯化阶段需要将蛋白质溶液浓缩10～50倍，以减小过程体积并使随后的操作更容易处理，这在规模化纯化蛋白质时是个重要的必不可少的步骤，超滤是比较合适的技术，一般采用错流系统。

.沉淀法在大规模工业生产中并不可取，因为这种方法处理量很小；引入的外来试剂必须在随后去除或者回收；对于很稀浓度蛋白质溶液，该方法处理效率不高，且收率很低；使用有机溶剂会造成维持设备的成本，生产区域的防火、防火花的成本较高。双水相萃取技术可以用于实验室规模或中试规模，但工业化规模还不多见。.（四）色谱分离采用色谱技术从粗产品中分离纯化蛋白质，在生产中始终都要慎重操作。经过浓缩后，得到了蛋白质、其他成分（比如类脂物、细胞壁或其他多糖类）、盐和水的混合液，随后一般经2～4步色谱纯化才能达到所要求的蛋白质纯度。可以从不同的色谱方法中进行选择，实验室实验结果有参考作用，专家系统也有助于优化蛋白质纯化的顺序。.首先采用典型操作（如吸附、双水相萃取或盐析沉淀等）来提高收率，减少纯化步骤，然后采用高效液相离子交换色谱或亲和色谱纯化蛋白质，得到99％（通常情况下95％～98％）纯度的产品。经过上述步骤之后，如果有需要，可进一步采取其他方法以获得超高纯度。.新发展起来的适用于规模化的是快速蛋白质液相色谱（fastproteinliquidchromatograph，FPLC）。FPLC在中等压力条件下工作，比传统色谱分离速度更快，分离效果更好。FPLC在实验室中被广泛接受，在中试和大规模蛋白质纯化中也显示出了强大的潜力。相比于高压系统（如HPLC），它的一个优点就是其设备用塑料而非不锈钢制成，可耐任何缓冲液，因而适于分离纯化蛋白质。.第二节生物大分子的提取蛋白质（包括酶），核酸，脂类，糖类等生物大分子的制备分四个阶段：一.选择材料和预处理二.细胞的破碎及细胞组分的分离三.提取和纯化四.浓缩，干燥和保存

.一.选择材料及预处理动物，植物，微生物都可作为制备生物大分子的原材料，所选用的材料主要依据试验目的来确定。

有效成份是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。而有效成分以外的其它物质则统称杂质。在动、植物和微生物材料中，有效成分的含量一般较少。如胰脏中胰岛素的含量小于其鲜重的百万分之一；稳定性较差，大多数对酸、碱、高温和高浓度有机溶剂等因子较敏感；易被微生物分解变质。

材料的采集会大大影响实验的成敗,选用的材料不同，有效成分的含量就不同；同一材料的部位或生长期不同，有效成分的含量也不尽相同。总的来说，材料选择应遵循的原则是，有效成分含量多、稳定性好；来源丰富、保持新鲜；提取工艺简单、有综合利用价值等。

.1.动物组织：选材：必须选择有效成分含量丰富且易分离的脏器组织为原材料。如磷酸单酯酶，从含量看，虽然在胰脏、肝脏和脾脏中较丰富，但是因其与磷酸二酯酶共存，进行提纯时，这两种酶很难分开。所以实践中常选用含磷酸单酯酶少，但几乎不含磷酸二酯酶的前列腺作材料。

脱脂：脏器中含量较高的脂肪，容易氧化酸败，导致原料变质影响纯度操作和制品的率。常用的脱脂方法有：人工剥去脏器外的脂肪组织；浸泡在脂溶性的有机溶剂（丙酮，乙醚）中脱脂；采用快速加热（50℃左右），快速冷却的方法，使溶化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去。

.

保存：对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存。a.冰冻：剥去脂肪和筋皮等结缔组织，短期保存：－10℃的冰箱内；长期保存：－70℃低温冰箱内。b.干燥：对于像脑垂体一类小组织，可置丙酮液中脱水，干燥后磨粉储存备用；对于含耐高温有效成分（如：肝素）的肠粘膜，可在沸水蒸煮处理，烘干后能长期保存。

冰箱的除霜循环，可能对細胞造成伤害，要特別小心。解冻時要越快越好，但避免局部過熱。.2.植物材料：选材：注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。种子须泡胀或粉碎才可使用。含油脂较多的也要进行脱脂处理。

a.提取核DNA：选用黄化苗（生长7－10天小麦，水稻），防止叶绿体DNA的干扰b.提取RNA：根据实验目的选用生长幼嫩组织为好。

保存：冷冻采样后尽快放于－4℃――20℃冰箱内。DNA,RNA采样后，N2速冻，至－70℃冰箱。对RNA样，如不立即使用，冷冻保存尤为重要。.3.微生物：选材：应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：

a.利用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等。一般用离心法收集上清液，上清液只能在低温下短期保存

b.利用菌体含有的生化物质，如：蛋白质，核酸和胞内酶等。需破碎菌体细胞分离，湿菌体可低温短期保存，冻干粉可在4℃保存数月。3..二.确定测定方法在效成分在原材料中含量较低，纯化是使其纯度增高的过程，因此，提取和分离的每个步骤均要测定有效成分的含量。测定方法要专一、准确、灵敏和简便。使用较多的测定方法有分光光度法、荧光分析法、生物活性(如酶活力、激素活性)测定、电泳分析等，有时可用电化学法和免疫分析法。.三.细胞的破碎1.机械破碎：(1)研磨法：剪碎的动物组织如鼠肝、兔肝等置研钵中，用研磨棒研碎。为了提高研磨效果，可加入一定量的石英砂。用匀浆器处理，也能破碎动物细胞。此法较温和，适宜实验室使用。但加石英砂时，要注意其对有效成分的吸附作用。如系大规模生产时，可用电动研磨法。细菌和植物组织的细胞破碎均可用此法。.(2)组织捣碎器法：用捣碎器(转速8000-10000r/m)处理30-45s可将植物和动物细胞完全破碎。如用其破碎酵母菌和细菌的细胞时，须加入石英砂才有效。但是在捣碎期间必须保持低温，捣碎的时间不易太长，以防温度升高引起有效成分变性。现在多用细胞破碎仪。(3)超声波法：借助声波的震动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。多用于微生物细胞的破碎，一般输出功率100-200W，破碎时间3—15min。如果在细胞悬浮液中加石英砂则可缩短时间。为了防止电器长时间运转产生过多的热量，常采用间歇处理和降低温度的方法进行。.(4)压榨法：是一种温和、彻底破碎细胞的方法。用30MPa左右的压力迫使几十毫升细胞悬液通过一个小孔(＜细胞直径的孔)，致使其被挤破、压碎。(5)冻融法：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下(或40℃左右)迅速融化。如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀、破碎。.2.溶涨和自溶：

溶涨：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液如低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象称溶胀。例如红血球置清水中会迅速溶胀破裂并释放出血红素。自溶：细胞结构在本身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等作用下，发生溶解的现象称自溶。应用此法时要特别小心操作，因为水解酶不仅可使细胞壁、细胞膜破坏，同时也可将某些有效成分在自溶时分解。.

3.化学处理：

用脂溶性的溶剂(如丙酮、氯仿、甲苯)或表面活性剂(如十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠)处理细胞时，可将细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类或DNA等物质，并导致整个细胞破碎。

.4.生物酶降解：生物酶(如溶菌酶)有降解细菌细胞壁的功能。在用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消解，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。例如从某些细菌细胞提取质粒DNA时，不少方法都采用了加溶菌酶(来自蛋清)破坏细胞壁的步骤。当有些细菌对溶菌酶不敏感时，可加巯基乙醇（ME）或者8mol/L的尿素，以促进细胞壁的消化。另外，也可加入蛋白酶K来提高破壁效果。而在破坏酵母菌的细胞时，可采用蜗牛酶进行。一般对数期的酵母细胞对该酶较敏感。将酵母细胞悬于0.1mol/L柠檬酸/磷酸氢二钠缓冲液(pH5.4)中，加入1%蜗牛酶，在30℃处理30分钟，即可使大部分细胞壁破裂，如同时加入0.2%巯基乙醇效果更好。.四.抽提1.抽提的含义：

抽提通常是指用适当的溶剂和方法从原材料中把有效成分分离出来的过程。经过处理的原材料中的有效成分可用缓冲液、稀酸、稀碱、或有机溶剂（如丙酮、乙醇）等抽提，有时还可用蒸馏水抽提。一般理想的抽提液应具备下述条件：对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质不溶解或溶解度很小；来源广泛、价格低廉、操作安全等。.2.抽提的影响因子在抽提阶段，pH值、金属离子、溶剂的浓度和极性等因子，可明显影响有效成分的性质和数量。因此选择抽提液必须考虑这些因素。（1）pH值：改变溶质解离状态。对蛋白质或酶等具有等电点的两性电解质物质，一般选择抽提液的pH值应在偏离等电点的稳定范围内。通常碱性蛋白质选用低pH值的溶液抽提，酸性蛋白质选用高pH值的溶液抽提，或者用调至一定pH值的有机溶剂抽提。注意：当用酸，碱控制溶液pH值时，要边加边搅，防止局部出现过高的酸，碱浓度造成蛋白变性。

.(2)溶剂的极性和离子强度：有些生物大分子在极性大、离子强度高的溶液中稳定；有些则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。例如提取刀豆球蛋白A时，用0.15mol/L甚至更高浓度的NaCl溶液，都可使其从刀豆粉中溶解出来，稳定存在。而抽提脾磷酸二酯酶时，则需用0.2mol/L蔗糖水溶液。一种物质溶解度大小与溶剂性质密切相关（相似相溶原理）；离子强度通过影响溶质的带电性也影响溶质的溶解度。降低极性：在水溶液中加蔗糖，甘油，二甲亚砜，二甲基甲酰氨。.提高离子强度：在水溶液中加中性盐（KCl,NaCl,NH4Cl,(NH4)2SO4）一般离子强度较低的中性盐溶液可促进蛋白溶解（盐溶），高离子强度的中性盐可引起蛋白质沉淀，析出（盐析）。高离子强度使DNA溶解度增加；低离子强度使RNA溶解度增加（核酸分离依据）。常用的盐溶液是NaCl溶液，浓度以0.15mol/L为宜。但是在提取核蛋白或细胞器中的蛋白质时，为促使蛋白质与核酸、蛋白质与细胞器分离，则宜用高浓度(0.5-2.0mol/L)的盐溶液。.(3)水解酶：细胞破裂后，许多水解酶释放出来。水解酶与欲抽提的蛋白质或核酸接触时，一旦条件适宜，就会发生反应，导致蛋白质或核酸分解，而使实验失败。为此，必须采用加入抑制剂，调节抽提液的pH、离子浓度或极性等方法，使这些酶丧失活性。如：提取，纯化胰岛素时，为阻止胰蛋白酶活化，采用68％的乙醇溶液（pH2.5-3.0,用草酸调节），在13－15℃抽提3h，可得到较高的回收率。因为68％乙醇可使胰蛋白酶暂时失活，草酸可除去蛋白酶的激活剂Ca2+，酸性环境也抑制酶蛋白活性。RNA提取需防止RNase的水解作用，RNase活性很高，很容易使RNA降解，所以每一步都严格控制RNase，可采用DEPC（焦碳酸二乙脂）处理，带手套操作，提取液中加强的变性剂异硫氰酸胍等措施。

.(4)温度：一般认为蛋白质或酶制品在低温(如0℃左右)时最稳定。例如：在生产人绒毛膜促性腺激素(HCG，糖蛋白)制品时，一定要在低温下进行。当温度低于8℃时，从200公斤孕妇尿中可提取约100克HCG粗品(活力为160u/mg)；当温度高于20℃时，从400公斤孕妇尿中都提取不到100克粗品，而且活力很低。此外，高温下制备的HCG粗品很难进一步纯化至3500u/mg，原因是高温会使HCG受到微生物和/或糖苷酶的破坏。一般提高温度，溶解度增加，但易使大分子物质变性失活。小分子物质：50－70℃；生物大分子：0－10℃，最好控制在0－4℃.（5）搅拌：搅拌能促使欲抽提物与抽提液的接触，并能增加溶解度。但是，一般宜采用温和的搅拌方法，速度太快时容易产生泡沫，导致某些酶类变性失活。（6）氧化：一般蛋白质都含相当数量的巯基，该基团常常是酶和蛋白质的必须基团，若抽提液中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子间的二硫键，导致酶(或蛋白质)失活(或变性)。在提取液中加入巯基乙醇，半胱氨酸。还原性谷胱甘肽等还原剂，可防止巯基发生氧化，使蛋白，酶失活。.（7）金属离子：蛋白质的巯基除易受氧化剂作用外，还能和金属离子如铅、铁或铜作用，产生沉淀复合物。这些金属离子主要来源于制备缓冲液的试剂中。解决的办法：①用无离子水或重蒸水配制试剂；②在配制的试剂中加入1-3mmol/L的EDTA(金属离子络合剂)。（8）抽提液与抽提物的比例：在抽提时，抽提液与抽提物的比例要适当，一般以5∶1为宜。如抽提液过多，则有利于有效成分的提取，但不利于纯化工序的进行。.第三节离心分离技术离心技术在生物科学，特别是在生物化学和分子生物学研究领域，已得到十分广泛的应用，每个生物化学和分子生物学实验室都要装备多种形式的离心机。离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。.一.基本原理：⒈离心力（centrifugalforce，Fc）：

当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到的离心作用力“Fc”由下式定义：

Fc=m·a=m·ω2r

a：粒子旋转的加速度，m：沉降粒子的有效质量，ω：粒子旋转的角速度，r：粒子的旋转半径(cm)。

.⒉相对离心力（relativecentrifugalforce，RCF）:

由于在转速相同的情况下，离心力会随离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。

X为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重力加速度（980cm/sec2）；n为转子每分钟的转数（revolutionsperminute,简写成r/min,或rpm）。

22.一般在低速离心时（转速小于5000r/min），离心力的大小常用r/min来表示，而超速离心时则用g或×g来表示。由于离心管中从管口到旋转中心的距离是不同的，所以在同样转速时，管口和管底所受到的离心力也有差别。例如：在某个角度转头中，离心管口到旋转中心的距离为4.8cm，而离心管底到旋转中心的距离是8.0cm，当转速为12000r/min是，离心管口和离心管底所受到的相对离心力RCF分别是：RCF（管口）=1.118×10-5×(12000)2×4.8=7734gRCF（管底）=1.118×10-5×(12000)2×8.0=12891g科技文献中离心力的数据通常是指其平均值（RCFav），即离心管中点的离心力。旋转轴340rminravrmax.为便于进行转速和相对离心力之间的换算，Dole和Cotzias利用RCF的计算公式，制作了转速“rpm”、相对离心力“RCF”和旋转半径“r”三者关系的列线图，图式法比公式计算法方便。换算时，先在r标尺上取已知的半径和在rpm标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，与图中RCF标尺上的交叉点即为相应的相对离心力数值。.⒊沉降系数（sedimentationcoefficient，s）：根据1924年Svedberg对沉降系数下的定义为颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。若ω用2πn/60表示，则X1：离心前粒子到旋转轴的距离。X2：离心后粒子到旋转轴的距离。S：一般在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，量纲为秒。例如，动物细胞的核糖体沉降系数等于80S，它的含义就是：80×10-13s。细胞及细胞的各组分的沉降系数有很大的差异，所以可以利用生物样品沉降系数的差异采用离心技术将他们彼此分开。

.5.沉降系数与物质相对分子质量:由沉降系数根据Svedberg公式可以计算出物质的相对分子质量：

Mr=RTS20,w/[D20,w(1-γρ)]Mr：相对分子质量；D20,w：以20℃的水为介质时颗粒的扩散系数；R:气体常数；T：绝对温度；S20,w：以20℃的水为介质时颗粒的沉降系数；γ：偏比容，等于溶质粒子密度的倒数；ρ：溶剂密度。

.6.沉降时间（sedimentationtime，Ts）:在实际工作中，常常需要在已有的离心机上把某一种溶质从溶液中全部沉降分离出来，这就必须首先知道用多大转速与多长时间可达到目的。如果转速已知，则需确定分离某粒子所需的时间。根据沉降系数（S）式可得积分得X2:离心转轴至离心管底内壁的距离；X1:离心转轴至样品溶液面之间的距离，将（t2－t1）用Ts表示：其中的(lnXmax−lnXmin)/ω2为一常数，称k常数或k值。.二.离心机的主要构造和类型：离心机可分为工业用离心机和实验用离心机。实验用离心机又分为制备性离心机和分析性离心机，制备性离心机主要用于分离各种生物材料，每次分离的样品容量比较大，分析性离心机一般都带有光学系统，主要用于研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质，依据待测物质在离心场中的行为（用离心机中的光学系统连续监测），能推断物质的纯度、形状和相对分子质量等。分析性离心机都是超速离心机。.1.制备性离心机可分为三类:

低速离心机:最大转速6000rpm左右，最大相对离心力近6000×g，容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离。可用水平转头，角度转头，其转速不能严格控制，通常不带冷冻系统，于室温下操作，用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。这种离心机多用交流整流子电动机驱动，电机的碳刷易磨损，转速是用电压调压器调节，起动电流大，速度升降不均匀，一般转头是置于一个硬质钢轴上，因此精确地平衡离心管及内容物就极为重要，否则会损坏离心机。.

高速离心机：最大转速为20000-25000rpm（r/min），最大相对离心力为89000×g，最大容量可达3升，分离形式也是固液沉降分离，通常配有各种角式转头、荡平式转头、区带转头、垂直转头和大容量连续流动式转头、一般都有制冷系统，以消除高速旋转转头与空气之间摩擦而产生的热量，离心室的温度可以调节和维持在0-40oC，转速、温度和时间都可以严格准确地控制，并有指针或数字显示。通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、蛋白质的硫酸铵沉淀物和免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分子。..

超速离心机：大于30×103r/min，最大离心力600,000g，有驱动和速度控制系统，温度控制系统，真空系统（减少摩擦）。新式的有微处理机（按编定程序运转，自动计算速度和时间）。有40多种不同容量和性能的转头给用户选择。离心容量由几十毫升至2升，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，离心管平衡允许的误差要小于0.1克。超速离心机的出现，使生物科学的研究领域有了新的扩展，它能使过去仅仅在电子显微镜观察到的亚细胞器得到分级分离，还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。.

角式转头是指离心管腔与转轴成一定倾角的转头。它是由一块完整的金属制成的，其上有4-12个装离心管用的机制孔穴，即离心管腔，孔穴的中心轴与旋转轴之间的角度在20-40度之间，角度越大分离效果越好。优点是具有较大的容量，且重心低，运转平衡，寿命较长，颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管壁，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧就会出现颗粒沉积，此现象称为“壁效应”。壁效应容易使沉降颗粒受突然变速所产生的对流扰乱，影响分离效果。.⑵荡平式转头：这种转头有4或6个自由活动的吊桶（离心套管），当转头静止时，吊桶垂直悬挂，当转头转速达到每分钟200到800转时，吊桶荡至水平位置，这种转头最适合做密度梯度区带离心优点是梯度物质可放在保持垂直的离心管中，离心时被分离的样品带垂直于离心管纵轴，而不像角式转头中样品沉淀物的界面与离心管成一定角度，因而有利于离心结束后由管内分层取出已分离的各样品带。其缺点是颗粒沉降距离长，离心所需时间也长。..⑶区带转头：区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成，转子桶中装有十字型隔板装置，把桶内分隔成四个或多个扇形小室，隔板内有导管，梯度液或样品液从转头中央的进液管泵入，通过这些导管分布到转子四周，转头内的隔板可保持样品带和梯度介质的稳定。.沉降的样品颗粒在区带转头中的沉降情况不同于角式和外摆式转头，在径向的散射离心力作用下，颗粒的沉降距离不变，因此区带转头的“壁效应”极小，可以避免区带和沉降颗粒的紊乱，分离效果好，而且还有转速高，容量大，回收梯度容易和不影响分辨率的优点，使超离心用于制备和工业生产成为可能。区带转头的缺点是样品和介质直接接触转头，耐腐蚀要求高，操作复杂。.⑷垂直转头：其离心管垂直放置，样品颗粒的沉降距离短，离心所需时间也短，适用于密度梯度区带离心，离心开始时和结束时液面和样品区带要作九十度转向，因而降速要慢。.⑸连续流动转头：可用于大量培养液或提取液的浓缩与分离，转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成，离心时样品液由入口连续流入转头，在离心力作用下，悬浮颗粒沉降于转子桶壁，上清液由出口流出。

.3.离心管离心管主要用塑料和不锈钢制成：塑料离心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能较好。塑料离心管的优点是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。塑料离心管都有管盖，离心前管盖必须盖严，倒置不漏液。管盖有三种作用：①防止样品外泄。用于有放射性或强腐蚀性的样品时，这点尤其重要。②防止样品挥发。③支持离心管，防止离心管变形。.4.分析性离心机分析性离心机使用了特殊设计的转头和光学检测系统，以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程。从而确定其物理性质。利用特殊配置的数据处理机自动计算s(沉降系数)和Mr。主要用于生物大分子的相对分子质量测定，估价样品纯度和检测生物大分子构象的变化等。主要产品有美国Beckman公司的ModelE及日本日立公司的282型。..分析性超速离心机的转头是椭圆形的，以避免应力集中于孔处。转头通过一个有柔性的轴联接到高速的驱动装置上，转头在低温和真空的腔室中旋转，转头上有2-6个装离心杯的小室，离心杯是扇形石英的，可以上下透光，离心机中装有光学系统，在整个离心期间都能通过紫外吸收或折射率的变化监测离心杯中沉降着的物质，在预定的期间可以拍摄沉降物质的照片，在分析离心杯中物质沉降情况时，在重颗粒和轻颗粒之间形成的界面就像一个折射的透镜，结果在检测系统的照像底板上产生了一个“峰”，随着沉降的不断进行，界面向前推进，因此峰也移动，从峰移动的速度可以计算出样品颗粒的沉降速度。分析性超速离心机的主要特点就是能在短时间内，用少量样品就可以得到一些重要信息，能够确定生物大分子是否存在，其大致的含量，计算生物大分子的沉降系数，结合界面扩散，估计分子的大小，检测分子的不均一性及混合物中各组份的比例，测定生物大分子的分子量，还可以检测生物大分子的构象变化等。.三.离心分离方法的选择1.差速离心法：

这是最普通的离心法。即采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。差速离心首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间。当以一定的离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加大转速下再进行离心，又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和较轻颗粒的上清液，如此多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。此法所得的沉淀是不均一的，仍杂有其它成分，需经过2-3次的再悬浮和再离心，才能得到较纯的颗粒。..

此法主要由于组织匀浆液中分离细胞器和病毒，其优点是：操作简易，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点是：须多次离心，沉淀中有夹带，分离效果差，不能一次得到纯颗粒，沉淀于管底的颗粒受挤压，容易变性失活。.2.密度梯度离心：又称速率区带离心法。是在离心前于离心管内先装入密度梯度介质（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。离心后在近旋转轴处（X1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（X2）介质的密度最大，但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即ρP＞ρm。这种方法是根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20%的沉降系数差或更大）或相对分子质量相差3倍的蛋白质。大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。.离心管先装在密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带。沉降系数越大，往下沉降越快，所呈现的区带会越靠近离心管底。.由ρP＞ρm可知S＞0，因此该离心法的离心时间要严格控制，既有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带，又要控制在任一粒子达到离心管底之前。如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有分离。离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达1.28kg/cm3和60％。此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是用于分离大小相异而密度相似的物质。.3.等密度离心：

密度梯度液包含了被