高等植物基因工程

高等植物基因工程第1页，课件共64页，创作于2023年2月第二节植物基因工程方法一、植物遗传转化的方法

植物遗传转化技术可分为两大类：（一）生物介导的转化方法主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。（二）直接基因转移技术包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。第2页，课件共64页，创作于2023年2月

1、农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A.tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。（一）生物介导的转化第3页，课件共64页，创作于2023年2月Ti质粒（Tumorinducedplasmid）第4页，课件共64页，创作于2023年2月

T-DNAT-DNA长约23kb（15kb-30kb

）

，共有三套基因：AuxinCytokininOpine合成的植物生长素与细胞分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。

第5页，课件共64页，创作于2023年2月Ti质粒（Tumorinducedplasmid）环状ds-DNA,160-250kb，具六个功能区致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解Ti质粒转移区(tra)：参与在不同农杆菌中的接合转移毒性区（Vir）（Virulenceregion)

：直接参与T-DNA的转移和插入植物染色体DNA复制区（Rep）：参与Ti质粒DNA复制第6页，课件共64页，创作于2023年2月根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化分子机理整个过程分为以下6个步骤：

1）农杆菌对受体的识别

2）农杆菌附着到受体细胞

3）诱导和启动毒性区基因表达

4）类似接合孔复合体的合成和装配

5）T-DNA的加工和转运

6）T-DNA与受体基因的整合第7页，课件共64页，创作于2023年2月Ti质粒作为载体的优点宿主范围广，能转化所有的双子叶植物整合到染色体上后成为染色体的正常组分永远保留冠瘿碱合成酶基因启动子是一个强启动子第8页，课件共64页，创作于2023年2月Ti质粒的改造策略天然的Ti质粒不能作为表达载体使用的原因：

a.

植物转化细胞产生大量的生长素和分裂素，阻止了生长在培养基上的细胞再生长为整株植物，因此，必须除去生长素和分裂素基因。

b.

有机碱的合成与T-DNA的转化无关，而且会影响植物细胞生长，因为有机碱合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，因此必须去除有机碱合成基因（tmt）。

c.

Ti质粒过大，重组操作非常困难，也很难找到单一的酶切位点。

d.Ti质粒不能在大肠杆菌中复制。第9页，课件共64页，创作于2023年2月Ti质粒的改造为了使重组质粒DNA的大量扩增，添加大肠杆菌复制子；加入植物细胞的筛选标记，如neor基因（新霉素磷酸转移酶基因）；使用植物细胞启动子及末端polyA化信号；加入多聚人工接头以利于外源基因的克隆。

植物中一般不存在质粒，为利用农杆菌的Ti质粒，发展了一元载体系统和双元载体系统，避免了在大的Ti质粒上进行分子重组操作的困难。

第10页，课件共64页，创作于2023年2月用于植物基因转化的Ti质粒载体系统一元载体系统/共整合载体系统双元载体系统第11页，课件共64页，创作于2023年2月一元载体系统Transgenicplant目的基因oriSelectableMarkerGene中间载体Ti质粒AuxinCytokininOpineL/RBorder第12页，课件共64页，创作于2023年2月1、Ti质粒进行卸甲处理。2、将目的基因构建于中间载体上。3、在卸甲载体T-DNA区插入一段与中间载体同源的质粒序列。4、然后将中间载体转移到含有卸甲载体的根癌农杆菌中，中间载体通过同源重组整合到卸甲载体的T-DNA区，并与卸甲Ti质粒一起复制。5、根据中间载体上所携带的抗性基因进行抗性筛选，获得遗传重组根癌农杆菌菌株。6、使用这种菌株去侵染植物组织细胞，就可以获得含有目的基因的转基因植物。卸甲载体中间载体共整合系统（一元载体系统）要点第13页，课件共64页，创作于2023年2月二元载体系统TransgenicplantvirorirepMCSTi质粒AuxinCytokininOpineL/RBorder目的基因第14页，课件共64页，创作于2023年2月二元载体系统（双元载体系统）要点1、微型Ti质粒缺失Vir区，T-DNA区进行卸甲处理；2、引入多个酶切位点和广谱的复制元件；3、把外源基因重组于微型Ti质粒上；4、辅助质粒去掉T-DNA区，Vir区仍然存在；5、把微型质粒转入含有辅助质粒的根癌农杆菌中，随后侵染植物组织；6、两种Ti质粒可通过反式作用将含有外源基因的T-DNA区转移到植物组织细胞中。微型Ti质粒辅助Ti质粒第15页，课件共64页，创作于2023年2月转化程序（1）选择外植体叶片、子叶、胚轴、…

选择转化能力较强幼期外植体最佳感受态时期外植体易于组培，再生外植体要暴露分生组织细胞，增加农杆菌与分生组织细胞接触面。根癌农杆菌转化的一般步骤第16页，课件共64页，创作于2023年2月（2）共培养

农杆菌溶液接种到外植体损伤切面浸泡一段时间。然后洗掉非伤面菌液转到培养基上共培养（将接种农杆菌的外植体置于诱导培养基上，此时农杆菌随外植体的细胞分裂而繁殖并进行侵染，T-DNA转移整合，此过程叫共培养）。

第17页，课件共64页，创作于2023年2月

（3）脱菌共培养后转到含有杀农杆菌抗生素的培养基上脱菌羧卞青霉素250mg/L

头孢500mg/L

羧吩青霉素四环素和利福平（4）再生筛选第18页，课件共64页，创作于2023年2月

2、病毒介导的遗传转化植物病毒广泛存在，而且不受单子叶或双子叶的限制。因此病毒作为植物基因工程的载体日益受到人们的重视。在已知300种特征清楚的植物病毒中，双链DNA病毒、单链DNA病毒各占3%。RNA不适合于作为克隆载体，因为RNA的操作非常困难。在植物上已知有两种DNA病毒，花椰菜花叶病毒（Cauliflowermosaicvirus,CaMV）和双联体病毒（geminivirus），但都不是基因克隆的理想载体。

花椰菜花叶病毒载体已用来克隆了一个基因进入芜箐甘蓝，有两个因素限制了其应用：

1）花椰菜花叶病毒基因组的大小，即使是切除了非必需序列，花椰菜花叶病毒载体的承载插入片段的能力还是有限的，只能插入很小的片段。

2）花椰菜花叶病毒的寄主范围非常窄，主要是芸苔属植物如芜菁、甘蓝和花椰菜等。

二价病毒可能比较有潜力，侵染重要的作物，如玉米和小麦，然而在侵染过程中，二价病毒重新排列并删除部分序列，搅乱插入的DNA序列。这种病毒可引起破坏性的侵染，需要严格的防护，防止载体从寄主中逃逸侵染自然中的植物。所以花椰菜花叶病毒和二价病毒作为克隆载体还需要进一步的改造。第19页，课件共64页，创作于2023年2月（二）DNA直接转移法农杆菌侵染双子叶植物获得转基因植株是非常成功的，但自然界中的农杆菌只侵染双子叶植物，对单子叶植物不敏感。虽然通过添加乙酰丁香酮类物质可使农杆菌侵染单子叶植物，但单子叶植物的再生比较困难，因而农杆菌转化单子叶植物仍然是比较困难的。

1984年，科学家发现，超螺旋结构的细菌质粒，虽然不能在植物细胞中复制，但可以重组整合到植物染色体内。受这一现象的启发产生基因直接转移技术。重组机制并不清楚，因为细菌质粒与植物DNA之间没有同源性，事实上整合是随机发生在植物染色体的任何位点。第20页，课件共64页，创作于2023年2月DNA直接转移法基因枪法原生质体法脂质体法花粉管通道法电激转化法PEG介导转化方法等。第21页，课件共64页，创作于2023年2月1.基因枪法第22页，课件共64页，创作于2023年2月（1）定义基因枪法（particlegun）又称微弹轰击法（microprojectilebombardment,particlebombardment,biolistic)。它是把遗传物质或其它物质附着于高速微弹上直接射入组织、细胞、细胞器内，完成整合并表达的基因转化的方法。最早是由Cornell大学研制的火药基因枪。1990年，美国杜邦公司推出了商品基因枪PDS-1000系统。基因枪的组成部分由点火装置、发射装置、挡板、样品室、真空系统组成。第23页，课件共64页，创作于2023年2月（2）动力系统炸药爆破力gunpower

高压气体（highpressuregas）高压放电（3）DNA颗粒载体的制备利用CaCl2对DNA沉淀作用；亚精氨、PEG的粘附等作用将DNA固定在颗粒表面。第24页，课件共64页，创作于2023年2月（4）金属颗粒

金粉：规则的球形，比表面积大，DNA吸附力强

钨粉：廉价，易得，但易在细胞表面形成有害的氧化物第25页，课件共64页，创作于2023年2月基因枪转化率

基因枪转化率差异很大，一般在10-3~10-2之间。McCabe在大豆上高达2%，而有的报道仅有10-4。相对于农杆菌介导的转化率要低得多，而且基因枪转化成本高；嵌合体比率大、遗传稳定性差。第26页，课件共64页，创作于2023年2月尽管基因枪法有很多缺陷，但在单子叶植物上也有广泛应用，优点有：

a)无宿主限制，无论是单子叶植物和双子叶植物都可以应用。

b)受体类型广泛，原生质体、叶圆片、悬浮培养细胞、茎、根、以及种子的胚、分省组织、愈伤组织、花粉细胞、子房等几乎所有具有分生潜力的组织或细胞都可以用基因枪进行轰击。

c)可控度高，商品化的基因枪都可以根据实验需要调控微弹的速度和射入浓度，命中特定层次的细胞。

d)操作简便迅速。

正因为基因枪这些优点，使基因枪成功的应用于：植物基因转化，特别是单子叶植物的转化；外源基因导入植物细胞器；种质转化（茎尖分生组织、配子体、胚胎细胞）；植物基因表达调控研究。第27页，课件共64页，创作于2023年2月2.多聚物介导转化：利用多聚物PEG、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等在二价阳离子作用下，促进DNA在原生质体表面形成沉淀，继而通过原生质体的内吞噬作用而被吸收进入细胞内。多聚物促进细胞融合的原理：多聚物使细胞膜之间或DNA与膜之间形成分子桥，促进相互间的接触和粘连，在细胞融合的过程中，DNA进入细胞。第28页，课件共64页，创作于2023年2月磷脂介导（Phospholipidsasgene-deliveryvehicles）脂质体(liposomes)是一种人造的脂质小泡，外周是脂双层，内部是水腔。第29页，课件共64页，创作于2023年2月3.电穿孔法将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生质体悬浮液中，混合物在200-600V/cm的电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在组织培养基中生长1-2周，再生出整株植物。第30页，课件共64页，创作于2023年2月（1）定义：利用显微注射仪通过机械方法将DNA注入细胞质或核内。4.显微注射法（microinjection):第31页，课件共64页，创作于2023年2月（2）细胞固定（对植物来言）：琼脂糖包埋法多聚赖氨酸粘连吸管支持法（3）优缺点：转化率高，10-20%甚至60%

繁琐耗时，需要专门的显微注射仪，要求精密操作技术和低密度培养技术。第32页，课件共64页，创作于2023年2月

5、花粉管通道法在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。

利用花粉管通道将DNA转移至胚囊，转化尚不具正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎组织。目前已应用于水稻、小麦、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的转基因研究。

第33页，课件共64页，创作于2023年2月第三节转化子细胞的筛选采用某种转基因方法处理外植体后，通常外植体中仅有少数细胞获得转化。只有采取有效的筛选方法，才能高效准确地选择到转化细胞。筛选方法主要有两种：

解毒基因筛选选择基因为一解毒基因，可以消除培养基中有害物质（如抗生素、除草剂等）对细胞生长的抑制作用；而非转化细胞不能在含有有害物质的培养基中生长。

营养缺陷型筛选受体细胞为营养缺陷型细胞，不能在选择性培养基中增殖，而选择基因可以补偿这种缺陷，使转化细胞在选择性培养基上正常生长。第34页，课件共64页，创作于2023年2月一、植物基因工程中的选择基因植物基因工程中的选择标记基因主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因。1、新霉素抗性基因（neor）2、庆大霉素抗性基因（gentr）3、潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）4、膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）第35页，课件共64页，创作于2023年2月1、新霉素抗性基因（Neomycinephosphotransferase–II,NPT-II，neor

）由大肠杆菌转座子Tn5中分离。选择试剂：卡那霉素、新霉素、G418（氨基糖苷类抗生素）。neor可使选择试剂磷酸化而失效（即催化ATP上的γ-磷酸转移到诸如新霉素、卡那霉素、庆大霉素和G418等抗生素分子的某些基团上。）。该类抗生素通过干扰70s核糖体的功能抑制蛋白质合成，阻碍了原核生物蛋白质的合成。对植物细胞的毒性机理是通过干扰植物细胞叶绿体、线粒体中核糖体的功能而抑制叶绿体和线粒体蛋白质的合成。该基因广泛应用于双子叶植物，单子叶中也有成功应用。第36页，课件共64页，创作于2023年2月2、庆大霉素抗性基因（gentr）gentr编码乙酰转移酶。选择试剂：庆大霉素。gentr编码乙酰转移酶可使庆大霉素乙酰化而失活。该基因在矮牵牛、烟草和番茄转基因筛选中有较广泛应用。第37页，课件共64页，创作于2023年2月3、潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）潮霉素是一种很强的细胞生长抑制剂，对许多植物都有毒性。选择试剂：潮霉素。hpt可使选择试剂磷酸化而失活。该基因广泛应用于单子叶植物，特别是水稻的转基因研究，是一种选择效率很高的选择基因。第38页，课件共64页，创作于2023年2月4、膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）由吸水链霉菌中克隆。选择试剂：膦丝菌素（basta)。膦丝菌素可抑制谷氨酰胺合成酶活性，从而导致非转化细胞氨的致死性积累。Bar编码的膦丝菌素乙酰转移酶可使膦丝菌素乙酰化而失活。该基因广泛应用于禾谷类作物以及大豆、油菜等油料作物的转基因研究。第39页，课件共64页，创作于2023年2月报告基因是指其编码产物能够被快速测定、常用于盘底外源基因是否成功地导入受体细胞（器官或组织），是否启动表达的一类特殊用途基因。报告基因与选择基因的区别在于：二、植物基因工程中的报告基因选择基因往往需要与外界的筛选压力如抗生素等相互作用，以筛选转化细胞；二报告基因的应用不需要外界选择压力的存在。第40页，课件共64页，创作于2023年2月理想报告基因应具备的条件1、受体细胞不存在相应的内源等位基因活性；2、它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞；3、具有检测快速、灵敏、价廉且可定量、重复测定特性。第41页，课件共64页，创作于2023年2月目前常用报告基因1、β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）2、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）3、

荧光素酶基因（

luc）4、绿色荧光蛋白基因

（gfp）第42页，课件共64页，创作于2023年2月1、β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）gus基因存在于某些细菌体内。编码β-葡萄糖苷酸酶。检测的底物有3种，

1）X-gluc5-溴-4氯-3-吲哚葡萄糖苷、5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-glucuronide；

2）PNPG

对硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷、p-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside。

3）4-MUG

4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖醛酸、4-methylumbelliferylß-D-glucuronide第43页，课件共64页，创作于2023年2月X-gluc5，5’-二溴-4，4’-二氯靛蓝（蓝色，显色）

(5-溴-4-氯-3-吲哆葡萄糖醛苷酸)4-MUG

4-甲基伞形酮（荧光物质）＋β-D-葡萄糖醛酸（4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖醛酸）荧光，荧光分光光度计PNPG对硝基苯酚（溶液呈黄色，PH=7.15，400~420nm）（4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖醛酸）分光光度计GUSGUS（1）GUS基因的检测十分简单、方便和灵敏。（2）绝大多数植物中没有检测到该酶的背景活性。（3）GUS基因还可用来进行嵌合基因的构建和分析。优点：GUS第44页，课件共64页，创作于2023年2月2、氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因

cat基因是由大肠杆菌易位子Tn9所编码的，它可以催化乙酰CoA转乙酰基到氯霉素分子,导致氯霉素分子发生乙酰化作用，从而失去活性。真核生物无该基因，无该酶内源活性。该酶活性可以通过反应底物乙酰CoA的减少或反应产物还原型乙酰CoA的生成来测定，目前常用的方法有硅胶G薄层层析法及DTNB分光光度法。

CAT1—乙酰氯霉素

CoA＋氯霉素2—乙酰氯霉素（氯霉素失效）

3—乙酰氯霉素优点：克服了受体细胞非特异性酶本底较高的缺点，且CAT酶定量分析准确。第45页，课件共64页，创作于2023年2月3、荧光素酶（LUC）基因

来源：从北美荧光虫和叩头虫的cDNA文库中克隆出来的。功能：luc基因所编码的荧光素酶是生物体催化自身发光的一种蛋白。该酶在有ATP、Mg2+、O2和荧光素存在的条件下可发射出荧光，荧光持续数秒到数分钟即消失，可用微光测定仪检测到非常微弱的荧光素酶分子。荧光光度计（1）LUC测定灵敏度非常高（2）LUC检测法成本低（3）免于放射性同位素检测对人体健康和生态环境所造成的危害。（4）该酶的活性不需要转录后修饰，可以在几乎所有的宿主细胞中表达。优点：插入了萤火虫荧光素酶基因的烟草,由于荧光素酶基因的表达使得烟草发光.第46页，课件共64页，创作于2023年2月4、绿色荧光蛋白（GFP）基因

来源：海洋生物水母，其基因可在异源组织中表达并产生荧光。功能：gfp

开放阅读框架长度约740bp，编码238个氨基酸残基，其肽链内部第65～67位丝氨酸-脱氢酪氨酸-甘氨酸通过自身环化和氧化形成一个发色基团，在长紫外波或蓝光照射下发出绿色荧光。检测：可在荧光显微镜或流式细胞仪中直接观察基因的表达。GreenFluorescentProtein(GFP)第47页，课件共64页，创作于2023年2月外源基因是否整合到染色体上？整合方式如何？整合到染色体上的外源基因是否表达？基因表达是否产生了完整的蛋白质？是否产生了目的性状？

需要通过以下鉴定与证实分子生物学鉴定表型鉴定遗传学鉴定第四节转化体的鉴定与证实第48页，课件共64页，创作于2023年2月外源基因转化验证内容和技术外源基因是否整合

PCR技术(需要注意假阳性问题、外源基因仍有可能以游离形式存在问题)Southern杂交外源基因表达

RT-PCR技术(假阳性问题)Northern杂交

Western杂交第49页，课件共64页，创作于2023年2月第五节植物基因工程应用第50页，课件共64页，创作于2023年2月转基因作物

抗病虫害抗非生物胁迫(逆境)提高作物产量、品质花卉植物基因工程植物医药基因工程第51页，课件共64页，创作于2023年2月一、抗性基因工程抗病虫害抗非生物胁迫(逆境)第52页，课件共64页，创作于2023年2月抗植物病虫害基因的应用抗虫基因Bt基因蛋白酶抑制基因植物凝集素基因淀粉酶抑制剂基因毒素蛋白基因（Bt）第53页，课件共64页，创作于2023年2月Bt基因抗虫应用i.来源：苏云金杆菌（Bacillusthuringiensis,Bt）在形成芽孢的过程中，产生具有高度特异性杀虫活性的杀虫结晶蛋白（insecticidalcrystalprotein,ICP）ii.原理：死亡ICP原毒素昆虫停止进食细胞渗透平衡破坏形成细胞膜孔道与肠道上皮细胞上特异性蛋白结合毒性多肽ICP在昆虫碱性肠道内活化昆虫取食第54页，课件共64页，创作于2023年2月抗植物抗毒病基因的应用抗病毒基因cp基因（病毒外壳蛋白基因）病毒复制酶基因反义RNA介导抗病毒缺陷型运动蛋白介导抗病毒植物体内的抗病毒基因缺陷干扰颗粒抗病毒核糖体失活蛋白基因干扰素基因病毒卫星RNA第55页，课件共64页，创作于2023年2月抗植物真菌病害基因的应用植物病原菌致病