高中生物选修三基因工程的基本操作程序

高中生物选修三基因工程的基本操作程序第1页，课件共50页，创作于2023年2月补充：1.原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片段，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落)第2页，课件共50页，创作于2023年2月①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区原核细胞的基因结构②有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子第3页，课件共50页，创作于2023年2月编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：2.真核细胞的基因结构第4页，课件共50页，创作于2023年2月真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA

聚合酶结合位点等。非编码序列：包括非编码区和内含子第5页，课件共50页，创作于2023年2月原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码第6页，课件共50页，创作于2023年2月1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤第7页，课件共50页，创作于2023年2月一、目的基因的获取(一)、目的基因主要是______________________编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成请阅读P9第一和二两段第8页，课件共50页，创作于2023年2月1、从基因文库中获取目的基因

将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库基因文库

基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）（1）.基因文库第9页，课件共50页，创作于2023年2月某生物体内全部DNA许多DNA片段受体菌群体1、从基因文库中获取目的基因限制酶与运载体连接导入基因组文库某种生物某个时期的mRNAcDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入部分基因文库（cDNA文库）第10页，课件共50页，创作于2023年2月第11页，课件共50页，创作于2023年2月①基因组文库的构建（2）.基因文库的构建方法通过对受体菌的培养而储存基因第12页，课件共50页，创作于2023年2月②cDNA文库的构建-----反转录法：

以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA单链DNA反转录酶DNA聚合酶双链DNA(目的基因)第13页，课件共50页，创作于2023年2月③基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较第14页，课件共50页，创作于2023年2月（3）构建基因文库的目的

怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?便于在不知道目的基因核苷酸序列的情况下，获得所需的目的基因。第15页，课件共50页，创作于2023年2月依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA

基因翻译产物蛋白质等特性（4）从基因文库中得到目的基因的方法——直接分离法(鸟枪法)第16页，课件共50页，创作于2023年2月①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、

_______________、___________、___________.②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：多聚酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增2、利用PCR技术扩增目的基因第17页，课件共50页，创作于2023年2月⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加___倍一第18页，课件共50页，创作于2023年2月⑥过程：第19页，课件共50页，创作于2023年2月PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增第20页，课件共50页，创作于2023年2月DNA复制PCR技术场所原理条件解旋方式酶特点结果PCR技术扩增与DNA复制的比较碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋变复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶等第21页，课件共50页，创作于2023年2月蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化学合成推测推测3、人工合成法：在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？第22页，课件共50页，创作于2023年2月1.作用：二.基因表达载体的构建-核心IMN2.组成：①使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代。②同时使目的基因能表达和发挥作用。(3)终止子：是使转录在需要的地方停止(4)标记基因：是鉴别受体细胞中是否含有目的基因从而将含有目的基因的细胞筛选出来(2)启动子：是RNA聚合酶识别和结合部位(1)目的基因

不同受体细胞，目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建有所差异。（5）复制原点：是转录和复制的起点。第23页，课件共50页，创作于2023年2月二、基因表达载体的构建——核心质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因第24页，课件共50页，创作于2023年2月寻根问底：将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？有人采用总DNA注射法进行遗传转化：即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体细胞，没有进行表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体细胞。此法目前争议颇多，严格来说不算基因工程。第25页，课件共50页，创作于2023年2月资料:

科学家在培育抗虫棉时，起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。

然后在插入抗虫基因的质粒中插入抗虫基因启动子，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入抗虫基因终止子，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。资料证明：表达载体构建组成要完整第26页，课件共50页，创作于2023年2月①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意第27页，课件共50页，创作于2023年2月2.下列属于获取目的基因的方法的是()①利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取③从受体细胞中提取④利用PCR技术⑤利用DNA转录 ⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥1．在已知基因的核苷酸序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是

A、化学合成法

B、基因组文库法

C、CDNA文库法

D、聚合酶链反应第28页，课件共50页，创作于2023年2月3.在基因工程中，把选出的一个目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4次，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（）个A.540

B.8100

C.17280

D.7560第29页，课件共50页，创作于2023年2月4.目的基因与运载体结合所需的条件有①同一种限制酶②具有抗性基因的质粒③RNA聚合酶④目的基因⑤DNA连接酶⑥四种脱氧核苷酸⑦ATPA．①②③④⑤⑥⑦B．①②④⑤⑥⑦C．①②③④⑤D．①②④⑤⑦5.（多选）一个基因表达载体的构建应包括

A．目的基因B．启动子

C．终止子D．标记基因ABCDD第30页，课件共50页，创作于2023年2月常用的受体细胞：

大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。三.目的基因导入受体细胞转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。第31页，课件共50页，创作于2023年2月①特点:

农杆菌转化法：（1）将目的基因导入植物细胞能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物没有感染能力②过程：Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上③适用生物：双子叶植物、祼子植物。第32页，课件共50页，创作于2023年2月Hind限制性酶ⅠⅡHindIIIHindIII目的DNATi质粒苏云金杆菌构建表达载体Bt毒素蛋白基因

苏云金杆菌DNA连接酶

T-DNA(可转移-DNA)

知识拓展农杆菌转化法的过程：第33页，课件共50页，创作于2023年2月基因枪法：

利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法①操作方法：②金属粒：将目的基因导入单子叶植物细胞

钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.6～4um。③适用：单子叶植物第34页，课件共50页，创作于2023年2月适用于单子叶植物基因枪法第35页，课件共50页，创作于2023年2月花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞①操作方法：②特点：

在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含目的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞十分简便经济③例：转基因抗虫棉第36页，课件共50页，创作于2023年2月胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊第37页，课件共50页，创作于2023年2月花粉管通道法适用于被子植物第38页，课件共50页，创作于2023年2月①细胞类型：②操作程序：___显微注射法：（2）将目的基因导入动物细胞发育成新性状动物移植到子宫或输卵管培养成早期胚胎显微注射取受精卵（体内或体外受精）提纯含目的基因表达载体受精卵第39页，课件共50页，创作于2023年2月③常用法：②常用菌：①微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少④过程：大肠杆菌Ca2+处理获得感受态细胞Ca2+处理大肠杆菌感

受

态

细

胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA___感受态细胞法（3）将目的基因导入微生物细胞第40页，课件共50页，创作于2023年2月（3）.将目的基因导入微生物细胞

大肠杆菌细胞最常用的转化方法是:

首先用Ca2+处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞.

第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程.

第二步目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。第41页，课件共50页，创作于2023年2月四

目的基因的检测与鉴定

导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组

DNA分子吗？真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。

目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？不一定，需要检测1.检测方法：分子杂交技术：（1）DNA分子与DNA分子的之间杂交（2）DNA分子与RNA分子的之间杂交（3）蛋白质分子（抗原与抗体）之间杂交2.个体生物学水平的鉴定：抗虫、抗病接种实验，活性比较实验第42页，课件共50页，创作于2023年2月1.检测转基因生物的DNA探针15N15N14N14N（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因基因探针：放射性同位素等标记的DNA分子方法：DNA分子杂交技术变性变性第43页，课件共50页，创作于2023年2月DNA分子杂交原理：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对进行。因此，当用探针和转基因生物的DNA杂交时，如果出现杂交带（用特殊的显影装置可以看见），则说明目的基因已插入受体细胞的染色体DNA中。基因探针：是一小段单链的DNA或RNA