DNA复制基础知识-课件

第四章DNA的复制

Chapter4DNAReplication2020/11/241第四章DNA复制

DNAReplication1引言---基因组复制与细胞分裂的关系2复制子3DNA复制的几种形式4DNA聚合酶5原核生物DNA复制的基本过程6真核生物DNA复制7DNA复制的调控8小结2020/11/242精品资料3你怎么称呼老师？如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？教师的教鞭“不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘……”“太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”4重点内容：

①几个重要概念：DNA的复制、复制子、复制眼、复制叉、DNA聚合酶、DNA的半保留复制、DNA的半不连续复制、DNA的先导链、DNA的后随链、冈崎片段；②不同生物基因组复制子数目；③线性DNA复制末端问题的提出及解决方案；④θ-复制、滚环复制及D-环复制的机制；⑤大肠杆菌DNA聚合酶I、II、III的性质比较，DNA聚合酶Ⅰ与缺口平移法制备探针；⑥DNA复制的起始、延伸及终止。了解内容：

①基因组复制与细胞分裂的关系；②复制叉移动方向的确定；真核生物DNA聚合酶的种类及各自的功能；③DNA复制的调控。

2020/11/2451引言---基因组复制与细胞分裂的关系细胞在每次分裂的过程中，整个基因组都必须精确地复制一次。如何保证这一点？两个原则(1)DNA复制的启动决定了细胞的进一步分裂;(2)复制过程完成前，细胞是不会发生分裂的。2020/11/2462复制子(replicon)2.1复制子的定义2.2不同生物复制子的数目2.3复制眼概念2.4复制叉概念及其移动方向的实验确定2.5复制的模式---起点、方向和速度2020/11/2472.1复制子的定义DNA中发生一次复制的单位称为复制子(replicon)。复制子是根据它含有复制所需的控制元件来定义的，在复制启动位点具起始点（origin)，在复制终止位点具终点（terminus)。起始点仅作用于所在复制子。

注：在每个细胞周期中，每个复制子发生一次复制，且只发生一次。2020/11/248质粒一般是一个自主环状的DNA基因组，构成一个独立复制子；原核生物基因组中一般只含一个复制子，在唯一的起始点启动就会引起整个基因组复制；真核生物基因组含多个复制子（一般40-100kb/个）。

2.2不同生物复制子的数目2020/11/2492.3复制眼概念

复制眼：在一个长的未复制区域内DNA已经复制的区域2020/11/2410Replicationeye2020/11/2411复制叉:双螺旋DNA两条亲本链分开使复制能进行的部位。2.4复制叉的概念及其移动方向的确定2020/11/2412复制叉移动方向的确定放射性自显影法：对于大基因组内的不确定区域，两次连续的放射脉冲可以用来标记复制的移动。如果一个脉冲比另一个脉冲强，我们可以用相对的标记强度来区分，这些可用放射自显影观察。单向复制：在复制眼的一端，一种类型的标记后紧跟着另一种标记；双向复制：在复制眼的两端产生一种（对称的）模式。在真核生物中普遍存在。2020/11/24132.5复制的模式---起点、方向和速度单起点、单方向多起点、单方向单起点、双方向多起点、双方向2020/11/24143DNA复制的几种形式3.1线性DNA双链的复制3.2环状DNA双链的复制2020/11/24153.1线性DNA双链的复制3.1.1线性DNA复制的具体表现3.1.2线性DNA复制时末端问题的提出3.1.3线性DNA复制时末端问题的解决方案2020/11/24163.1.1线性DNA复制的具体表现2020/11/2417

3.1.2线性DNA复制时末端问题的提出所有已知的核酸聚合酶，无论是DNA聚合酶还是RNA聚合聚合酶都只从5`端向3`端移动，新链的合成方向与聚合酶移动方向一致，即只能是5`→3`；而对于DNA的合成必需一段引物的存在，体内DNA复制时，由一段RNA引物起始DNA合成，起始后它必须切除，切除后，5`端如何起始呢？这就提出了线性DNA末端复制的问题。2020/11/24182020/11/2419复制能在新合成链的3`端结束，它如何在5`端启动呢？2020/11/2420

3.1.3线性DNA复制时末端问题的解决方案(1）通过将线性复制子转变为环状或多聚分子。如λ噬菌体：滚环产生多聚复制子）；(2）某种蛋白质可能会介入，在真正的末端上启动。几种线性病毒核酸具有与5`端碱基共价结合的蛋白质，其中了解最清楚的例子是腺病毒DNA)。(3）DNA可形成特殊的结构，如在末端形成发夹。使分子没有游离末端。草履虫（Paramecium）的线性线粒体DNA的复制中就形成了一种交联；(4）末端是可变的，而不是精确确定的。真核生物染色体可能采用这种方式，在这种情况下，DNA末端的短重复序列的拷贝数改变（如端粒的复制）；2020/11/2421（1）通过将线性复制子转变为环状或多聚分子2020/11/2422TherollingcirclereplicatesDNAPhageλ2020/11/2423Arollingcircleappearsasacircularmoleculewithalineartailbyelectronmicroscopy.2020/11/24242020/11/2425Adenovirusterminalproteinbindstothe5`endofDNAandprovidesaC-OHendtoprimesynthesisofanewDNAstrand.（2）某种蛋白质介入而在真正的末端启动复制2020/11/2426AdenovirusDNAreplicationisinitiatedseparatelyatthetwoendsofthemoleculeandproceedsbystranddisplacement.（3）DNA末端形成特殊结构2020/11/2427AtypicaltelomerehasasimplerepeatingstructurewithaG-T-richstrandthatextendsbeyondtheC-A-richstrand.TheG-tailisgeneratedbyalimiteddegradationoftheC-A-richstrand.（4）末端长度可变2020/11/2428AloopformsattheendofchromosomalDNA.2020/11/2429The3single-strandedendofthetelomere(TTAGGG)ndisplacesthehomologousrepeatsfromduplexDNAtoformat-loop.2020/11/2430Watchingflash2020/11/24313.2环状DNA的复制3.2.1θ-复制3.2.2滚环复制3.2.3D-环复制2020/11/24323.2.1θ-复制

replicationbyθ-structure2020/11/24333.2.2滚环复制replicationbyrollingcyclesstructureφX174噬菌体由一个单链环状DNA组成，这条链称为正（+）链；合成的互补链称为负（一）链。双链体的复制以滚环复制方式进行。2020/11/2434TheAproteiniscis-actingPhageφX174Thereplicationbyrollingcyclestructure2020/11/24353.2.3D-环复制Replicationbydisplacementloopstructure2020/11/2436D-环复制（Replicationbydisplacementloopstructure)2020/11/24374DNA聚合酶4.1大肠杆菌DNA聚合酶的种类及其功能4.2真核生物DNA聚合酶的种类及其功能4.3DNA聚合酶所具有的共同结构2020/11/24384.1大肠杆菌DNA聚合酶的种类及其功能SOS修复2020/11/2439性质聚合酶I聚合酶II聚合酶III3`→5`外切+++5`→3`外切+--新生链的合成--+生物学活性10.0515生物学功能切除引物修复DNA修复DNA复制4.1.1大肠杆菌DNA聚合酶I、II、III的性质比较2020/11/2440（1）DNA聚合酶I

103kDa的单链多肽，可以被蛋白酶切成两段，C端的2/3包括聚合酶活性位点；N端的1/3包含核酸外切酶校正活性（一次可切除1-10个碱基）。（2）利用DNA聚合酶I进行缺口平移法制备探针的基本原理4.1.2DNA聚合酶I与缺口平移法制备探针2020/11/2441Nicktranslationreplacespartofapre-existingstrandofduplexDNAwithnewlysynthesizedmaterial.DNaseⅠ2020/11/24424.2真核生物DNA聚合酶的种类及其功能2020/11/24432020/11/2444真核生物由不同DNA聚合酶

分别负责起始和延伸三种细胞核DNA复制酶具有不同的功能:DNApolymeraseα起始新链合成DNApolymeraseδ延伸先导链DNApolymeraseε可能与后随链合成有关，也可能具有其他功能2020/11/24454.3DNA聚合酶所具有的共同结构许多DNA聚合酶有一个由三个结构域组成的大裂隙，类似于手形。2020/11/2446ThecommonorganizationofDNApolymeraseshasapalmthatcontainsthecatalyticsite,fingersthatpositionthetemplate,athumbthatbindsDNAandisimportantinprocessivity,anexonucleasedomainwithitsownactivesite,andanN-terminaldomain.2020/11/24475

原核生物DNA复制的基本过程5.1DNA复制的起始5.2DNA合成链的延伸5.3DNA复制的终止2020/11/24485.1.1单链DNA的产生5.1.23`-OH引发末端的产生5.1.3复制复合体的形成

5.1DNA复制的起始2020/11/24495.1.1单链DNA的产生解旋酶(helicase):使DNA的两条链分开，它通常利用ATP水解来提供必需的能量；2020/11/2450拓扑异构酶（DNATopisomerase）拓扑异构酶的种类分为Ⅰ型和Ⅱ型。原核拓扑构酶Ⅰ：MW=100kD，单肽链，含3~4个Zn。作用是暂时切断一条DNA链，形成酶-DNA共价中间物而使超螺旋DNA松弛，然后再将切断的单链DNA连接起来。每次改变一个连环数。2020/11/2451原核拓扑构酶Ⅰ作用机制：①酶与DNA结合使双链解旋；②使一条链切开，但酶与切口的两端结合阻止了螺旋的旋转；③酶使另一条链经过缺口，然后再将两断端连接起来；④酶从DNA上脱落，两条链复原，得到的DNA比原来少一个负超螺旋。2020/11/2452拓扑异构酶Ⅱ拓扑异构酶Ⅱ也称旋转酶。广泛存在于各种生物中。使正超螺旋转化为负超螺旋，每次改变两个连接数。2020/11/2453ReplicationmachineryreplicationPositivesupercoilBreakDNATopoisomeraseIIpassDNAthroughthebreaknegativesupercoil2020/11/2454单链结合蛋白（single-strandbindingprotein):单链DNA结合，阻止其再形成双链体状态φX174噬菌体的DNA在三种功能蛋白先后作用下分开成为单链：在复制起始点，噬菌体A蛋白使病毒（+）链产生缺口。Rep蛋白提供解旋酶活性，它使两链分离。SSB包绕单链形成稳定的单链形式。ThreeproteinsunwindφX174DNA2020/11/24555.1.23`-OH引发末端的产生2020/11/2456多种方法可以产生3`-OH末端1)3)2)2020/11/2457起始需要解旋酶、单链结合蛋白和引发酶5.1.3复制复合体的形成2020/11/24585.2DNA合成链的延伸5.2.1半保留复制合成两条新的DNA链5.2.2DNA的合成是半不连续的5.2.3连接酶将冈崎片段连接在一起5.2.4前导链和后随链的协调合成5.2.5DNA复制忠实性的控制

2020/11/2459(1)半保留复制的概念

DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制(semiconsertivereplication)。5.2.1半保留复制合成两条新的DNA链2020/11/2460(2)半保留复制实验证据（Meselson-Stahl)

1958年Meselson&stahl用同位素（15N）示踪标记加密度梯度离心技术实验,该实验跟踪了生长了三代的大肠杆菌，证明了DNA是采取半保留的方式进行复制。[15N][15N-14N][14N][15N-14N][15N-14N]2020/11/24615.2.2DNA的合成是半不连续的

（semidiscontinuousreplication)DNA复制在合成先导链（leadingstrand)时是连续的；而在合成后随链(laggingstrand)时是先形成小片段（Okazakifragment），随后再将它们连接而成大片段。因后随链是不连续合成的而先导链是连续合成的，所以我们称之为半不连续复制（semidiscontinuousreplication)。2020/11/2462两条新链具有不同的特征ThetwonewDNAstrandshavedifferentfeaturesOkazakifragment2020/11/24635.2.3连接酶（Ligase)将Okazakifragment连接在一起2020/11/24645.2.4前导链(Leadingstrand))和后随链(laggingstrand)的协调合成2020/11/24655.2.5DNA聚合酶控制复制的忠实性2020/11/2466DNA聚合酶造成的复制错误可分为两类：移码（frameshift):

指一个核