抗双链DNA抗体检测标准操作规程

抗双链DNA抗体检测标准操作规程××医院检验科临床免疫室作业指导书文件编号:XXX生效日期：共页第页1.目的规范检测血清或血浆中抗双链DNA(dsDNA)抗体的流程，确保检测结果的准确性及重复性。2.原理2．1·间接免疫荧光法：包被有绿蝇短膜虫的生物薄片和稀释的血清样本温育。如果样本是阳性的，特异性IgG、IgA和IgM抗体与鞭毛虫抗原结合。在第二次温育时，荧光素标记的抗人抗体与结合在生物基质上的抗体反应，形成荧光显微镜下所观察到的特异性荧光模式。孔板中孵育。如果患者样品中有相应抗体，就会与抗原结合。洗去未结合的部分，然后加入HRP标记的二抗，使其与微孔板中的抗原抗体复合物反应。洗去未结合的酶标。加入TMB底物，产生显色反应，颜色深浅与相应抗体量成正比。AdsDNA性微粒上包被的链霉亲和素(SA)反应，形成反应复合物，在磁场作用下，未结合的物质被洗涤液洗去，加入吖啶标记的鼠抗人IgG抗体(二抗)进行反应，与第一步孵育的复合物进行结合，形成抗原抗体二抗复合物，在反应混合物中加入预激发液和激发液，样本中的抗dsDNAIgG的量和分析仪光学系统测定到的相对光单位数(RLU)呈正比。3.标本要求3．2·样品收到后立即分离血清，不能及时测定的血清应于2~8℃保存。4.试剂与仪器性和阳性对照，荧光显微镜。4．3·化学发光法试剂与仪器：抗核抗体测定试剂盒，××化学发光免疫分析系统。5.操作步骤盐(PBS)吐温缓冲液；待测血样本用PBS吐温缓冲液1∶10稀释。5．1．2加样：将加样板放在泡沫板上，将25μl稀释后的血清样本加至加样板的每一反应区上，应避免产生气泡。5．1．3温育：将生物载片有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里，室温(18~PBS泡至少5min。5．1．5加样：将20μlFITC标记的抗人IgG(荧光二抗)加至洁净加样板的反应区上。杯中取出生物载片，用吸水纸擦去背面和边缘的水分后，立即盖在加样板的凹槽里，室温(18~25℃)温育30min。玻片直接放在泡沫板的凹槽里。滴加封片介质至盖玻片，每一反应区约10μl。从洗杯中取出一张生物载片，用吸水纸擦干背面和边缘的水分。将生物载片有生物薄片的一面朝下放在已准备好的盖玻片上。5．2．2在指定的孔中加入100μl稀释血清，同时加入100μl标准品或cutoff对照以及阴性和阳性对照。在室温孵育30min。用洗涤缓冲液洗3次。每孔加入100μl酶标。室温温育30min。用洗涤缓冲液洗3次。每孔加入100μlTMB底物。避光室温下温育30min。每孔加入100μl终止液，450nm读取吸光度。运行。6.校准定期对加样枪、洗板机、酶标仪、化学发光仪进行保养和校准。关键部件更换或者维修后也需校准。7.质控7．1·间接免疫荧光法：每批次的实验应带上阴性和弱阳性质控物，滴度结果的在控规则：阴性质控物必须阴性，阳性质控物结果在上下1个滴度内。LJ质控图，以Westgard多规则质控分析法判断在控或失控。7．3·××化学发光法：质控品至少每24h或每次定标后测试一次；质控品至少包含两个浓度水平的待测定物；质控结果应落在可接受的范围内，否则结果无效。8.结果判断·间接免疫荧光法：荧光模式(阳性反应)：间接免疫荧光法检测抗dsDNA抗体的标准基质是绿蝇短膜虫，绿蝇短膜虫拥有一个只含dsDNA而不含其他细胞核抗原的动基体。与动基体反应的抗体必然是抗dsDNA抗体。如果样本阳性，则可观察到鞭毛虫动基体均质和部分环形荧光。同时，阳性对照必须显示相同的荧光模式。如果样本阴性，则动基体不显示荧光，仅细胞核、鞭毛基体或细胞质的荧光应判断为阴性(表所示)。表所示IIF检测抗dsDNA结果判读抗体反应性结果结果解释1∶10阳性血清中未检出抗dsDNA抗体提示患有系统性红斑狼疮注：以出现阳性核型的最高稀释度作为检测的结果。8．2·酶联免疫吸附实验：以抗dsDNA抗体标准品浓度为横坐标，相应吸光度值为纵坐标制作标准曲线。待测血清抗dsDNA浓度可根据所测吸光度从标准曲线得出。二维码扫描到分析仪的主曲线校正而来。9.生物参考区间9．1·对定量实验，实验室应建立自己的参考区间。如用文献或说明书提供的参考区间，使用前应加以验证。反应性。视为有反应性。10.性能参数性血清的结果特异性荧光强度基本一致，阴性血清结果为阴性。10．1．3批间差异：用2份特征性血清对不同批号的产品进行检测，阳性血清的结果特异性荧光强度基本一致，阴性血清结果为阴性。双链DNA，没发现与其他自身抗原有交叉反应。敏感性：85％的SLE患者可检测到双DNA。11.临床意义抗dsDNA抗体是系统性红斑狼疮(SLE)最重要的标志性自身抗体，美国风湿病学会已将抗dsDNA抗体阳性列为SLE诊断标准