HLA-B27筛查检测标准操作规程

HLAB27筛查检测标准操作规程××医院检验科临床免疫室作业指导书文件编号:XXX生效日期：共页第页1.目的规范HLAB27检测的操作程序，保证项目的正常开展，使得测量数据和检测结果具有良好的溯源性、准确性和可靠性。2.原理HLAB27是Ⅰ型人类主要组织相容性抗原，在外周血主要表达在淋巴细胞表面。在流式细胞仪中，血液细胞在鞘液的包围和约束下，形成单细胞悬液高速由流动室喷嘴喷出，受激发光照射产生前向散射光(FSC)、侧向散射光(SSC)和荧光信号。前向角散射光与被测细胞直径的平方密切相关，反映细胞体积的大小。侧向角散射光对细胞膜、胞质及核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。而通过对荧光信号的检测和定量分析，可得到细胞表面HLAB27表达情况，从而判断全血样本HLAB27阴阳性结果。常见的几种试剂品牌采用的原理如下。BFITCBPE血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤(和固定)等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，测定HLAB7阴性而HLAB27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。BHLABFITCCD白(PE)单克隆抗体试剂加入人类全血样本中时，荧光素标记的抗体将特异地和白细胞表面的抗原结合。经染色的样本先BDFACSTM溶血素处理，溶解样本中的红细胞，然后进行洗涤和固定，最后进行流式细胞仪分析。CD3表面抗原结合，CD3抗体主要用于识别T淋巴细胞群，用于T淋巴细胞的圈门使用；PurifiedHLAB7抗体主要用于封闭细胞表面HLAB7抗原，降低假阳性。PE细胞法)和IgG2aFITC／IgG1PE双色同型对照(流式细胞法)两种试剂，后者使用与前者相应单克隆抗体亚型一致的免疫球蛋白，和样本反应时，与前者有着相同的非特异性结合水平，但是与相应抗原无特异性的反应。作为对照试剂，可以排除前者试剂中单克隆抗体与样本的非特异性反应，从而提高检测的准确度。3.标本要求EDTA管)。室温保存的抗凝全血，可稳定48h；染色固定后的样本在2~8℃条件下可稳定24h。4.试剂与仪器表所示流式细胞仪HLAB27检测试剂一览表(品牌A)试剂名称品牌剂型规格保存条件单克隆抗体 液体 钠2mg／mlBSA的PBS2~8℃A：甲酸配试剂液体70ml室温溶血剂B：碳酸钠等配试剂液体32ml碳酸钠等室温C：多聚甲醛配试剂液体14ml多聚甲醛室温鞘液液体10L—室温清洗液液体5L—室温荧光微球液体10ml—2~8℃定1个月。备注：具体成分详见表所示流式细胞仪HLAB27检测试剂一览表。表所示流式细胞仪HLAB27检测试剂一览表(品牌B)抗HLAB27FITC／CD3PE10×FACS溶血素HLAB27校准微球可用于50次检测，置于1．5ml含有明胶和含有少于50％二甘醇和少于15％甲醛可用于10次校准，存放于的10×BDFACS溶血素。在2~25℃下保存。使用时，用室温(20~25℃)的 试剂级水进行1∶10稀释。稀释后的的缓冲盐溶液中。微球用试剂如果使用玻璃容器保存于室温下，于设定HLAB27检测kappa)，用于T淋巴细胞的检测。2~8℃下保存。为1个月。8℃下保存。HLABFITCCDPerCP双色抗体试剂和溶血素 LAB7PE双色试剂(流式细胞法)、流式溶血剂(使用前用蒸馏水做10倍稀释，即溶血剂∶蒸馏缓冲液。5.操作步骤5．1．1按照检测要求，分别向已编好号的试管中加入20μl单克隆抗体和同型对照 (IgG2aFITC／IgG1PE)。分别向试管中加入混匀的100μl抗凝血。混匀，避光，室温孵育20~30min。溶血前确认A／B／C管路充满并能打出液体。上机测样(测B27一定要至少洗一遍方可上机检测)。30μl试剂A。5．2．2对每个样本管，使用新的微量移液器枪头往每个试管底部小心加入50μl混合均室温下(20~25℃)在暗处孵育15~20min。注意：在孵育过程中避免样本被阳光直接曝晒。在加样的过程中应认真操作以避免样本粘到试管壁上。如果全血样本粘在试管壁上，那么将无法被试剂染色。5．2．3将10×FACS溶解液稀释为1×；往每个试管内加入2ml室温的1×FACS溶解注意：避免细胞和溶解液过长时间的接触，否则会造成白细胞的破坏。50μl的残留液以避免打散沉淀物。低速充分涡旋试管使残留液内的沉淀物重新悬浮。速充分旋动3s。在室温下以200g离心5min；吸取上清液，试管内保留大约50μl的残留液以避免打散沉淀物。低速充分涡旋试管使残留液内的沉淀物重新悬浮。固定液已经充分混匀；在采样前，样本已固定30min。此时细胞可以在流式细胞仪上进行分析了。在流式分析前，将试管帽盖上或这覆盖试管，在2~8℃避光保存。固定的细胞应该在染色24h之内进行分析。在使用流式仪分析之前，低速充分旋动细胞以减少细胞的聚集。温。用室温纯化水进释至1×浓度，配制好的溶液在室温条件下储存，可稳定1个月。中的抗体试剂于已做好标记的流式管管底。将100μl已充分混匀的抗凝人外周全血加入试管底部。注意：避免操作中碰触流式管壁，管壁上的血液样本无法进行染色，会影响实验结果。室温放置的1×溶血素。漩涡混合器上轻轻振荡5s，室温(18~25℃)避光静置孵育15min。室温下300g离心5min，弃去上清。漩涡混合器上轻轻振荡5s，加入2mlPBS溶液。室温下300g离心5min，弃去上清。漩涡混合器上轻轻振荡5s，加入0．5mlPBS，2h内完成检测。瓶和仪器质控微球的批号信息。并在配套软件中完成仪器和HLAB27校准，待仪器和HLAB27校准通过后，方可开始样本检测。测模板)。CYTCD所示；再做HLAB27H柱状图中，读取T淋巴细胞群(CD3＋)，显示HLAB27所示。图所示HLAB27柱状图照，标记为1号。另一支试管中加入20μlHLAB27FITC／HLAB7PE双色试剂，标记为2号。5．4．1．2各吸取100μlEDTA抗凝静脉血分别加入1号和2号试管底部(避免将血样沾到试管壁上)。 (避免细胞和溶血素过长时间接触，否则会造成白细胞的破坏)。100μl，避免将管底的细胞沉淀悬起)，加入2ml磷酸盐缓冲液，轻旋混匀，使管底细胞重新悬起，300g离心5min，弃去上清(使用移液器小心吸取上清，使剩余液体为50~100μl，避免将管底的细胞沉淀悬起)。h检测)或多聚甲醛溶液(样本放置超过2h后检测)。HLABAuto板。左／右箭头按钮，切换到欲选择的盘号，单击孔位选择Isotype在样本盘上的位置。管在样本盘上的位置(样本下的所有试管的盘号自动保持一致，更换任何试管的盘号，该样本下其他试管会自动更改为与其一致的盘号)。选中工作单列表中待测样本的起始试管Isotype试管(非常重要，自动测试只识别工作单中起始试管以下的样本)。开始依次执行样本测定。转回至1号位朝外，此时可安全打开仓门，取出试管或卸下样本盘。检测同时也可根据需要，调整报告中的设门位置，统计结果随之更新。6.校准常用方式为使用试剂／仪器对应的质控微球溶液对仪器系统校准和电压标定。7.质控开机前使用HLAB27标准校准微球校准仪器，对于无厂家或第三方质控品的项目可在不同仪器之间进行比对。8.结果判断一般结果判断的流程都是通过设门圈定(T)淋巴细胞，然后根据门内抗HLAB27的平均荧光强度，并与判别界值相比较，大于或等于则判定为HLAB27阳性，小于则为HLA9.注意事项min9．3·试剂须避光保存，使用时试剂应尽可能短地暴露于光线下，建议将试剂恢复至室温 (20~25℃)。注意试剂盒上标注的失效日期，过期后请勿再使用。9．4·HLAB27抗体和其他若干种HLAB抗原发生交叉反应，最常见的是和HLAB7抗原反应。HLAB7阳性样本在FITC检测器中的LMF值，因此可能落在HLAB27阳性样本的范围内，导致假阳性的结果。结果必须和其他临床信息结合起来综合考虑。10.临床意义HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度为3000~4000kb，占人体整个基因的1／3000，HLAB27是HLAⅠ类基因中B位点上的一个等位基因，与多种疾病具有相关性，尤其是强直性脊柱炎(