第三节多肽和蛋白质类药物的生产课件

第三节多肽和蛋白质类药物的生产优选第三节多肽和蛋白质类药物的生产1.干扰素概述干扰素的种类干扰素的理化性质干扰素的生物学活性干扰素的临床应用干扰素的生产工艺路线1.1干扰素的种类概念（interferon，IFN）干扰素是一种细胞因子，它是机体感染病毒时，宿主细胞通过抗病毒应答反应，而产生的一组结构类似、功能相近的低分子糖蛋白。英文名称为Interferon，简称IFN。发现干扰素是1957年英国科学家Isaccs等发现的。他们把灭活的流感病毒作用于小鸡细胞，结果发现这些细胞产生了一种可溶性物质，这种物质能抑制流感病毒，并且能干扰其它病毒的繁殖，因此，他们将这种物质称为“干扰素”。以后科学家们进一步发现，机体对入侵的异种核酸（包括病毒）都产生干扰素以进行防御。当机体细胞受到病毒感染时，机体细胞产生干扰素，干扰病毒复制，它是机体抗病毒感染的防御系统。

天然干扰素分类1.根据来源、基因序列和氨基酸组成分类

I型干扰素IFNα、IFNβ、IFNτ、IFNω来源白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等功能抗病毒感染、抗肿瘤生长

免疫调节(较弱）

其中IFNα为多基因产物，有23种以上的亚型。II型干扰素干扰素γ（IFN)来源活化的T细胞和NK细胞产生功能免疫调节提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答趋化作用抗病毒和抗肿瘤作用（次要）2.根据动物来源确定分类，例如人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。

上市重组干扰素:α2a、α2b、α1b、β1b，γ1992年我国第一个基因工程药物IFNα1b获得国家一类新药证书。研发中的重组干扰素IFNω，临床阶段1.2干扰素的理化性质143-166aa；MW:18-40ku；pI:6.5-7.5；乙醚、氯仿敏感容易吸附玻璃、淀粉、醋酸纤维膜、琼脂和塑料等介质。Ⅰ型干扰素具有广谱的抗病毒活性，对多种病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用；但这种效应不是直接的，而是通过对宿主细胞的作用引起的。①对干扰素敏感的细胞表面存在于干扰素受体，核内有“抗病毒蛋白”基因，受干扰素作用后该基因活化，产生的抗病毒蛋白可阻止病毒mRNA翻译，并促进病毒mRNA降解。②干扰素能提高细胞表面MHCⅠ类分子的表达水平，受到病毒感染的细胞表面MHCⅠ类分子的增加有助于向Tc细胞递呈抗原，引起靶细胞的溶解。③干扰素可增强NK细胞对病毒感染的杀伤能力。1.3干扰素的生物学活性正常情况下组织或血清中不含干扰素，只有在某些特定因素的作用下才能诱使细胞产生干扰素。广谱抗病毒活性机制MW:18-40ku；01M磷酸缓冲液（pH7.表达产物166aa糖基化蛋白，22.1990，rhuIFNγ-1b；容易吸附玻璃、淀粉、醋酸干扰素生产工艺路线（1）1996，Avonex(Biogen)；生产工艺

1工艺流程图离心连续流离心机，16000r/min对巨噬细胞的作用IFNγ可使巨噬细胞表面MHCⅡ类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力；干扰素生产工艺路线（1）第一步干扰素基因的克隆(RTPCR)05M醋酸缓冲液（pH5.500～1000倍。优选第三节多肽和蛋白质类药物的生产表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体病毒复制抑制病毒复制信号转导IFN-aIFN-诱导蛋白诱导刺激胞核胞核抗肿瘤作用机制Ⅰ型干扰素能抑制细胞的DNA合成，减慢细胞的有丝分裂速度；这种抑制作用有明显的选择性，对肿瘤细胞的作用比对正常细胞的作用强

500～1000倍。另外，Ⅱ型干扰素也可通过增强机体免疫机制、加强免疫监督功能来实现其抗肿瘤效应。免疫调节活性机制免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响，如对巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等均有一定作用。对巨噬细胞的作用IFNγ可使巨噬细胞表面MHCⅡ类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。对淋巴细胞的作用干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因素的影响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后加入干扰素则能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFNγ能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL4，而且抑制IL4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。对其它细胞的作用IFNγ对其他细胞也有广泛影响①刺激中性粒细胞，增强其吞噬能力；②活化NK细胞，增强其细胞毒作用；③使某些正常不表达MHCⅡ类分子的细胞（如血管内皮细胞、某些上皮细胞和结缔组织细胞）表达MHCⅡ类分子，发挥抗原递呈作用；④使静脉内皮细胞对中性粒细胞的粘附能力更强，且可分化为高内皮静脉，吸引循环的淋巴细胞。1.4重组干扰素的临床应用广谱抗病毒活性（rhuIFNα）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。直接抗肿瘤活性（rhuIFNα）毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ）多发性硬化症rhuIFNβ1.5.干扰素生产工艺路线（1）体外诱生干扰素制备工艺Sendai病毒诱导人白细胞1989年IFNαn3/Alferon，批准上市产量低1gIFNα，需要3亿ml人血白细胞来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵潜在的血源性病毒污染的可能性干扰素生产工艺路线（2）人源转化细胞系培养生产工艺1999年IFNαn1/Wellferon,批准用于临床。优点首次实现大规模商业化生产。缺点活性低，退出临床应用。1996，Avonex(Biogen)；接种通入300L培养基的发酵罐，接种量10%。上市重组干扰素:α2a、α2b、α1b、β1b，γ功能免疫调节③使某些正常不表达MHCⅡ类分子的细胞（如血管内皮细胞、某些上皮细胞和结缔组织细胞）表达MHCⅡ类分子，发挥抗原递呈作用；浓缩调整溶液和电导，10ku超滤膜，0.1996，Avonex(Biogen)；Ⅰ型干扰素能抑制细胞的DNA合成，减慢细胞•菌种检查合格后，方可投产。广谱抗病毒活性（rhuIFNα）2、干扰素纯化工艺过程2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。配合SDSPAGE收集干扰素峰。提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力对淋巴细胞的作用干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因素的影响而产生不同的效应。提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力②活化NK细胞，增强其细胞毒作用；种子用LB培养基；干扰素生产工艺路线（3）上市产品：重组人干扰素rhuIFN1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；

1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；

2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys

表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:干扰素生产工艺路线（4）上市产品rhuIFNβ1a1996，Avonex(Biogen)；2002，Rebif(Serono)表达产物166aa糖基化蛋白，22.5ku工艺特点分泌表达，产量低，成本高,过程严格动物无限细胞系培养生产工艺：干扰素生产工艺路线（5）•宿主腐生型假单胞杆菌（Pseudomonasputida）•上市产品IFNα2b/安福隆•表达产物无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子结构和生物活性•工艺特点发酵周期短几个小时无需变性、复性过程，获得有活性产品纯化过程淘汰抗体亲和层析基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺2.基因工程假单胞杆菌的构建与保藏

基因工程假单胞杆菌菌种建立基因工程假单胞杆菌菌种特性菌种库的建立与保藏2.1、基因工程假单胞杆菌菌种建立第一步干扰素α2b基因的克隆第二步表达载体的构建第三步工程菌的构建第一步干扰素基因的克隆(RTPCR)

制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR，基因连接质粒,转化E.coli,筛选鉴定克隆。测序编码人IFNα2b基因序列,501bp，165aa。第二步表达载体构建•IFN基因与表达载体连接•转化大肠杆菌•筛选阳性克隆•获得序列正确表达载体第三步工程菌构建转化假单胞杆筛选高表达、稳定遗传的工程菌获得原始菌种菌体保存－20℃冰柜，不超过12个月。2、干扰素纯化工艺过程干扰素生产工艺路线（1）连续流离心机冷却的发酵液，16000r/min离心收集。0，电导值，10ku超滤膜，0.05M醋酸缓冲液（pH5.毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。上市重组干扰素:α2a、α2b、α1b、β1b，γ此外，ＬＡＫ细胞（不象Ｔ细胞）介导杀伤不受ＭＨＣ的约束。毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。基因工程假单胞杆菌的构建与保藏表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体强机体免疫机制、加强免疫监督功能来实现其制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR，概念（interferon，IFN）另外，Ⅱ型干扰素也可通过增•IFN基因与表达载体连接生产工艺

1工艺流程图②活化NK细胞，增强其细胞毒作用；发现干扰素是1957年英国科学家Isaccs等发现的。其他热原，内毒素，残留抗生素2.2基因工程菌的特性（1）具有宿主菌的特征细菌革兰氏阴性菌，有荚膜，无芽孢，杆状。生化特性:Ser，LVal、D/LArg和LThr为（2）工程菌的特征SmR、TcR、ApR（3）具有生产干扰素能力放射性免疫学效价不低于2.0×109IU/L。2.3菌种库的建立与保藏•QC：菌种特性、生产能力、质粒稳定性•菌种检查合格后，方可投产。

3.干扰素α2b的发酵工艺过程3.1摇瓶培养取保存工作种子批菌种，室温融化摇瓶培养30℃，pH7.0，250r/min，18±2h检测OD值和发酵液杂菌检查。3.2种子罐培养接种接入50L种子罐，接种量10%。培养30℃，pH7.0。控制级联调节通气量和搅拌转速DO为30%，3～4h，OD>4.0。检测显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。

3.3发酵罐培养接种通入300L培养基的发酵罐，接种量10%。控制级联调节通气量和搅拌转速。前4h30℃，pH7.0，DO为30%。4h后20℃，pH6.0，DO为60%，5～6.5h。终点控制OD值达9.0±1.0，5℃冷却水快速降温至15℃以下。检测发酵液杂菌检查3.4．菌体收集连续流离心机冷却的发酵液，16000r/min离心收集。菌体保存－20℃冰柜，不超过12个月。检测干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。4干扰素的分离纯化工艺过程4.1、干扰素分离工艺过程

4.2、干扰素的纯化工艺过程4.1干扰素α2b分离工艺过程菌体裂解预处理初级分离(1)菌体裂解

裂解缓冲液纯化水配制，2℃～10℃（pH7.5）使用保护剂EDTA，PMSF（苯甲基磺酰氟）。破碎－20℃菌体2厘米以下的碎块搅拌加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr冻融:细胞完全破裂，释放干扰素。(2)预处理沉淀加絮凝剂聚乙烯亚胺:2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。加凝聚剂醋酸钙溶液:2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。(3)离心

连续流离心机2℃～10℃，16000r/min收集上清液含有重组干扰素蛋白质杂质沉淀121℃、30min蒸汽灭菌,焚烧处理。（4）初级分离

盐析:4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。离心连续流离心机，16000r/min保存收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。4.2、干扰素纯化工艺过程溶解粗干扰素沉淀与疏水层析阴离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩凝胶过滤层析无菌过滤分装(1)溶解粗干扰素

配制纯化缓冲液超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45μm滤器和10ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至2℃～10℃。检查:缓冲液的pH值和电导值。溶解2℃～10℃，匀浆，完全溶解。(2)沉淀与疏水层析

等电点沉淀（1）磷酸调节至pH5.0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。疏水层析干扰素吸附在疏水层析柱中

除非疏水性蛋白洗脱与收集0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）。等电点沉淀（2）磷酸调节pH4.5，调节电导值40ms/cm，2℃～10℃，静置过夜超滤1000ku超滤膜过滤，除去大蛋白。透析除盐调整溶液pH8.0，电导值，10ku超滤膜，0.005M缓冲液。(3)阴离子交换层析与浓缩0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）平衡树脂。盐浓度线性梯度5～50ms/cm进行洗脱，配合SDSPAGE收集干扰素峰。浓缩调整溶液和电导，10ku超滤膜，0.05M醋酸缓冲液（pH5.0）中透析。（4)阳离子交换层析与浓缩用0.1M醋酸缓冲液（pH5.0）平衡树脂。上样，相同缓冲液冲洗。盐浓度线性梯度5～50ms/cm进行洗脱配合SDSPAGE收集干扰素峰。浓缩10ku超滤膜进行。(5)凝胶过滤层析洗涤液0.15MNaCl的0.01M磷酸缓冲液（pH7.0）清洗系统和树脂上样，相同缓冲液进行洗脱。合并干扰素部分1992年我国第一个基因工程药物IFNα1b获得国家一类新药证书。45μm滤器和10ku超滤系统，百级层流下收集。种子用LB培养基；干扰素是一种细胞因子，它是机体感染病毒时，宿主细胞通过抗病毒应答反应，而产生的一组结构类似、功能相近的低分子糖蛋白。工程菌为大肠杆菌，温度敏感型。连续流离心机冷却的发酵液，16000r/min离心收集。1996，Avonex(Biogen)；配合SDSPAGE收集干扰素峰。基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺15MNaCl的0.•IFN基因与表达载体连接离心连续流离心机，16000r/min冻融:细胞完全破裂，释放干扰素。2生产过程及工艺过程上市产品rhuIFNβ1a1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；IL2分子量为１４５００的糖蛋白，它刺激已被特异性抗原或致丝裂因数启动的Ｔ细胞增殖。主要用于肾癌、黑色素瘤和非何杰金淋巴瘤有效（Ｒｏｓｓｅｎｂｅｒｇ）。1992年我国第一个基因工程药物IFNα1b获得国家一类新药证书。此外，ＬＡＫ细胞（不象Ｔ细胞）介导杀伤不受ＭＨＣ的约束。(6)无菌过滤分装0.22μm滤膜过滤干扰素溶液分装－20℃以下的冰箱中保存。(7)检测项目

干扰素鉴别试验干扰素效价测定蛋白质含量，纯度测定，分子量宿主残余蛋白、残余DNA干扰素结构鉴定紫外光谱，肽谱，N端序列其他热原，内毒素，残留抗生素发酵法生产白细胞介素白细胞介素的结构与功能Interleukin，简称IL。目前批准上市的有IL2、IL6、IL12等。IL2分子量为１４５００的糖蛋白，它刺激已被特异性抗原或致丝裂因数启动的Ｔ细胞增殖。重组白介素－２可用于临床研究。主要用于肾癌、黑色素瘤和非何杰金淋巴瘤有效（Ｒｏｓｓｅｎｂｅｒｇ）。ＬＡＫ细胞代表１个有单核巨噬细胞，Ｂ和Ｔ淋巴细胞特征的异原的细胞体。这些ＬＡＫ细胞似乎对癌细胞有特异作用。此外，ＬＡＫ细胞（不象Ｔ细胞）介导杀伤不受ＭＨＣ的约束。生产工艺

1工艺流程图IL-2工程菌斜面摇瓶发酵制备包涵体洗涤与裂解凝胶过滤与复性检定与包装上市产品rhuIFNβ1a来源活化的T细胞和NK细胞产生连续流离心机冷却的发酵液，16000r/min离心收集。2、干扰素纯化工艺过程筛选高表达、稳定遗传的工程菌提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力199