第二章基因工程的工具酶

第二章基因工程的工具酶第1页，课件共28页，创作于2023年2月1.工具酶的概念应用与基因工程的各种酶的总称.大量应用的是核酸酶.切:限制性内切酶连:

DNA连接酶修饰酶，聚合酶第2页，课件共28页，创作于2023年2月/listplay/sJj53SXK_PQ/-TXTvgODA4I.html/listplay/sJj53SXK_PQ/u-6RLhVXzv0.html?FR=LIAN第3页，课件共28页，创作于2023年2月几乎所有细菌均可产生限制性内切酶。1962年，瑞士的W.Arber提出限制与修饰假说。限制性内切酶：识别特定序列DNA甲基化酶：甲基化该特定序列，保护细菌DNA第4页，课件共28页，创作于2023年2月2.限制性内切酶I型：随机切割，核酸内切酶，甲基化酶，ATP酶，DNA解旋酶II型：仅识别特定DNA序列，广泛应用III型：具有限制和修饰双重作用，应用较少第5页，课件共28页，创作于2023年2月限制性内切酶的命名基本名称具该酶的机体属名的第一个字母（大写）种名的前两个字母（小写）大肠杆菌Escherichiacoli流感嗜血菌Haemophilus

influenzae短杆菌Brevibacteriumalbidum粘质沙雷式菌Serratiamarcescens第6页，课件共28页，创作于2023年2月同一菌种具有不同的菌株或菌型基本名称

菌株或菌型(小写)大肠杆菌k型菌株Ecok流感嗜血菌d型菌株Hind限制酶由染色体外的成分，如病毒、质粒等引起基本名称质粒、病毒的辅助字母EcoR第7页，课件共28页，创作于2023年2月某一菌株具有多个不同的限制酶体系，用罗马字母表示发现的先后顺序Hind

II:EcoR

I:第8页，课件共28页，创作于2023年2月有的限制酶前冠以系统名R

：限制性核酸内切酶，常省略M：甲基化酶R.Hind

IIIM.Hind

III第9页，课件共28页，创作于2023年2月限制酶的识别位点II型限制酶的识别系统识别4~6个碱基对，一般富含GC；少数识别6个以上的碱基对，为稀有酶识别序列具有回文结构识别序列严格，少数仅识别一二位专一第10页，课件共28页，创作于2023年2月限制酶剪切方式产生5’突出的黏性末端产生5’突出的黏性末端产生平齐末端第11页，课件共28页，创作于2023年2月II型限制酶的反应条件U-一个单位的限制性内切酶合适的温度和缓冲液，20ul体系，1h降解1ugDNA所需酶量注意酶的稀释与保存第12页，课件共28页，创作于2023年2月影响限制酶活性的因素DNA纯度DNA甲基化程度酶切反应的温度DNA的分子结构缓冲液第13页，课件共28页，创作于2023年2月3.DNA连接酶连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。在DNA复制、修复及体内外重组过程中起着重要作用。第14页，课件共28页，创作于2023年2月连接机理一条DNA链上的3’游离羟基与另一条DNA链上的5’末端磷酸基团形成3’,5’-磷酸二脂键。第15页，课件共28页，创作于2023年2月DNA连接酶的种类(1).T4噬菌体DNA连接酶不受dNTP的抑制，催化DNA片断的连接。(2).E.coliDNA连接酶不能连接平端DNA,不能连接RNA。第16页，课件共28页，创作于2023年2月T4噬菌体DNA连接酶广泛应用，可以连接：两个带有互补黏性末端的双链DNA分子两个带有平头末端的双链DNA分子一条链带有切口的双链DNA分子RNA-DNA杂合体中RNA链切口，RNA末端与DNA连接第17页，课件共28页，创作于2023年2月DNA连接酶反应体系12~30℃下反应1~16h。黏性末端：12~16℃，保证退火、酶活性、反应速率间的平衡平头末端：10~20℃，10~100倍酶量终止反应：EDTA或75℃水浴第18页，课件共28页，创作于2023年2月影响连接反应的因素DNA末端的结构DNA片段浓度相对分子量反应温度离子浓度第19页，课件共28页，创作于2023年2月4.DNA聚合酶催化合成DNA的反应的酶第20页，课件共28页，创作于2023年2月DNA聚合酶分类依赖DNA的聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片段酶T4

DNA聚合酶T7

DNA聚合酶Taq

DNA聚合酶依赖于RNA的DNA聚合酶逆转录酶第21页，课件共28页，创作于2023年2月依赖DNA的DNA聚合酶(1)大肠杆菌DNA聚合酶I（E.coliDNApolI)：具有三种酶活性a、5’---3’DNA聚合酶活性CCGATA-OHE.coliDNApolICCGATAGCCTGGCTATCGGAMg2+dNTP

GGCTATCGGAb、3’---5’外切酶活性-校正作用CGCATCG-OHE.coliDNApolICGCATCGGCGMg2+dNTPGCGc、5’---3’外切酶活性CGCATTAGE.coliDNApolICATTAGGCGTAATCMg2+GCGTAATC第22页，课件共28页，创作于2023年2月大肠杆菌DNA聚合酶I制备杂交探针。Mg2+，低浓度DNA聚合酶I，同位素标记的核苷酸处理双链DNA产生单链DNADNA聚合酶I5’—3’外切酶活性和聚合酶活性同时发生，产生切口平移，形成带标记的DNA分子第23页，课件共28页，创作于2023年2月(2).Klenow酶：也称DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5’--3’外切酶活性Klenow酶的基本用途：a.补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端b.DNA片段的同位素末端标记c.cDNA第二链的合成d.双脱氧末端终止法测定DNA序列第24页，课件共28页，创作于2023年2月(3)TaqDNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶PCR反应扩增所需酶具5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性（4）逆转录酶体外mRNA为模板合成互补的DNA第25页，课件共28页，创作于2023年2月5.碱性磷酸酶去除DNA或者RNA的5‘’磷酸，可防止自身环化。

5’pDNA5’OHDNA5’pRNA5’OHRNA第26页，课件共28页，创作于2023年2月6.末端转移酶分子量60000D,在二价阳离子的作用下，催化dNTP加于DNA分子的3’羟基端。底物：带3’羟基端单链DNA或带3’羟基突出端的双链DNA。第27页，课件共28页，创作于2023年2月7.核酸酶S1S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（As