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文档简介
基因工程第二章基因工程的工具酶第1页,课件共53页,创作于2023年2月第一节限制性内切核酸酶(RestrictionEndonuclease)能专一性识别双链DNA上的特殊核苷酸序列,并使每条链的一个磷酸二酯键断开。来源:细菌、霉菌和蓝藻功能:细胞内限制性修饰系统的一部分,可以降解“入侵”的外源DNA第2页,课件共53页,创作于2023年2月限制性内切酶作为细菌体内保护自身、避免被噬菌体入侵的作用机制。第3页,课件共53页,创作于2023年2月一、限制性内切酶的命名和种类1.命名:生物的属名的第一个字母和种名的第一、二个字母命名,菌株的代号的一个字母,和罗马数字表示。第4页,课件共53页,创作于2023年2月EcoRIEscherichia属名Coli种类Ry13株系编号第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写;第二、第三个字母是该细菌的种名,用小写;第四个字母代表株名;用罗马数字表示发现的先后次序。第5页,课件共53页,创作于2023年2月2.限制性内切酶的种类:平端5′突出粘端3′突出粘端第6页,课件共53页,创作于2023年2月识别序列:在双链DNA分子能够识别的特殊核苷酸序列;一般为4-8bp1)二重旋转对称识别序列(回文序列)第7页,课件共53页,创作于2023年2月3.限制酶的特点
1).识别顺序和酶切位点
①识别4-8个相连的核苷酸
MboINGATCN;AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC:PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC;
SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGG
FokI5’-GGATG(N)9-3’3’-CCTAC(N)13-5’外侧,产生5’-端突起2)富含GC第8页,课件共53页,创作于2023年2月
3)对称性—双对称
EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’
4)切点大多数在识别顺序之内,也有例外
5)限制酶切后产生两个末端,末端结构是5’-P和3’-OH
2).
末端种类
1)3’-端突起,个数为2或4个核苷酸
PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’
2)5’-端突起,个数为2或4个核苷酸
EcoRI
5’-GAATTC-3’5’-GOH
PAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAP
HOG-5’第9页,课件共53页,创作于2023年2月3)
平齐末端
SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’
4)非互补的粘性末端a)切点在识别顺序之外的,如:FokIFokI5’-GGATG(N)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(N)13-5’3’-CCTAC(N)13
b)能识别简并顺序的,如:AvaI
AvaI
5’-CPyCGPuG-3’
CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG
第10页,课件共53页,创作于2023年2月5)相容性末端如:BamHIGGATCCBglII
AGATCTMboI,Sau3AINGATCN
上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连,由此形成的重组分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切,但BamHI和BglII的识别机率只有1/16。
BamHI+MboIA/C/G/TGATCT/C/G/A
BamHI和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端,相连后不能为两种酶所识别和酶切。
BamHI+BglIIA/GGATCT/C
不同末端的连接特性:除第4种末端不能进行不同DNA分子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外,其余4种末端可以相互连接。第11页,课件共53页,创作于2023年2月4.同尾酶(Isocaudamer)有些来源不同的限制酶,识别及切割序列各不相同,但却能产生出相同的粘性末端。MunI:5`-CAATTG-3`3`-GTTAAC-5`EcoRI:5`-GAATTC-3`3`-CTTAAG-5`5`-CAATTG-3`3`-GTTAAC-5`5`-GAATTC-3`3`-CTTAAG-5`重新连接后的序列:5`-CAATTC-3`3`-GTTAAG-5`两种同裂酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列,能否被原来的限制酶所识别和切割?第12页,课件共53页,创作于2023年2月5.异源同序酶(Isoschizomer,同裂酶)
1.定义:能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶
2.特点:1)识别相同顺序
2)切割位点的异同
KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG
6.限制酶的星反应(Staractivity)
1.
特点:限制酶识别序列特异性降低
2.
发生星反应的限制酶和条件(见下页)
3.
星反应的利用和避免第13页,课件共53页,创作于2023年2月表1具有星反应的限制性内切酶与条件限制酶诱发星活性的条件a识别序列AvaI1,2,4BamHI1-5,8GGATCN,GPuATCCBstI2,4BsuI2,4,6EcoRI1,2,4-6NAATTNHaeⅢ2,4HhaI2,4,7HindⅢ6HpaI1,2,4PstI1,2,4,7PvuⅡ2,4SalI1,2,4,7ScaI4-6,8SstⅡ2,4XbaI2,4,7a.1:亚乙二醇(45%);2:甘油(12%);3:乙醇(12%);4:高酶/DNA比(>25U/μg);
5:Mn++代替Mg++;6:pH8.5;7:二甲基亚砜(8%);8:无NaCl。
第14页,课件共53页,创作于2023年2月3.限制性内切酶作为基因工程常用工具酶的机制:第15页,课件共53页,创作于2023年2月第16页,课件共53页,创作于2023年2月3.定向克隆的机制:第17页,课件共53页,创作于2023年2月4.利用噬菌体克隆大片段DNA的机制:第18页,课件共53页,创作于2023年2月第19页,课件共53页,创作于2023年2月5.重组DNA片段的检测:1)抗药性筛选第20页,课件共53页,创作于2023年2月2)显色性筛选第21页,课件共53页,创作于2023年2月第22页,课件共53页,创作于2023年2月1.底物DNA:DNA的纯度、分子构型、识别序列的侧面序列、位点的偏爱和DNA甲基化有关系。2.限制性内切酶的用量:酶的活性单位:(U/μl)3.反应体系:20μl
DNA:3.0μl(1.0μg)
10XBuffer:2.0μl
Enzyme:0.5μl
ddH2O:14.5μl二、限制性内切酶的反应体系第23页,课件共53页,创作于2023年2月4.双酶切法:DNA:3.0μl(1.0μg)
10XBuffer:2.0μl
Enzyme1:0.5μl
Enzyme2:0.5μl
ddH2O:14.0μl5.双酶切注意事项:1)两个酶通用缓冲液中的活力;2)用量的控制;第24页,课件共53页,创作于2023年2月6.具体操作时应注意事项:①整个操作应在0℃进行,即在冰浴中进行,而且是在加入其它试剂之后,最后加入酶。②当切割大量DNA时,通常采用延长反应时间,减少酶的用量。③当DNA需2种或以上酶切时,应用通用缓冲液,若没有通用缓冲液时,只有用1种酶切完后,纯化酶切产物,再进行下一个酶切反应。
第25页,课件共53页,创作于2023年2月限制酶在各种缓冲液中的相对活性
第26页,课件共53页,创作于2023年2月DoubleDigestion(双酶切反应)时UniversalBuffer(通用缓冲液)的使用表
第27页,课件共53页,创作于2023年2月7.对酶切结果进行分析
通过限制性酶切可以得到一定数量的DNA片断,DNA带负电荷,因此,当DNA分子被置于电场中时它们就会向阳极迁移。这样就可以通过凝胶电泳对酶切DNA片段进行分离。第28页,课件共53页,创作于2023年2月第29页,课件共53页,创作于2023年2月第30页,课件共53页,创作于2023年2月内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。
完全消化(CompleteDigestion)
12341234第31页,课件共53页,创作于2023年2月只有有限数量的酶切位点被切开。通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。
局部消化
123414部分酶切(PartDigestion)第32页,课件共53页,创作于2023年2月第二节DNA连接酶(DNALigase)
1967年,世界上数个实验室几乎同时发现该酶。2.1基本性质:能将两段DNA拼接起来的酶,催化DNA相邻的5‘磷酸基团和3’羟基末断之间形成磷酸二酯键,封闭DNA单链缺口。第33页,课件共53页,创作于2023年2月2.2T4DNA连接酶的作用机制:①ATP+DNAligase(E)→E-AMP+PPi。②E-AMP上的AMP转移到DNA的5’磷酸根上,使其活化,释放出酶。③活化的5’磷酸根与相邻的3’羟基形成3’,5’-磷酸二酯键,并释放出AMP。
第34页,课件共53页,创作于2023年2月第35页,课件共53页,创作于2023年2月
8.1.3两种DNA连接酶比较
T4DNAligaseE.coliDNAligase来源T4
噬菌体大肠杆菌分子量68kD75kD辅助因子ATPNAD+底物1)双链DNA分子的粘、平端1)同源互补粘端
2)RNA-DNA杂合体、RNA链缺口2)双链分子中的单链缺口
3)双链DNA分子中的单链缺口应用范围广泛.效率高窄第36页,课件共53页,创作于2023年2月修复双链DNA缺口处的磷酸二酯键第37页,课件共53页,创作于2023年2月修复与RNA结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键第38页,课件共53页,创作于2023年2月连接多个平头双链DNA分子:第39页,课件共53页,创作于2023年2月注意:DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子,被连接的必须是双螺旋DNA分子的一部分。第40页,课件共53页,创作于2023年2月2.3DNA片段之间的连接2.3.1具互补黏性末端片段之间的连接基本原理:用DNA连接酶连接具有互补粘性末端DNA片段。第41页,课件共53页,创作于2023年2月2.4具平末端DNA片段之间的连接基本原理:直接用T4DNA连接酶连接.
第42页,课件共53页,创作于2023年2月2.5DNA片段末端修饰后进行连接1)DNA末端同聚物加尾后进行连接基本原理:利用末端脱氧核苷酸转移酶转移核苷酸的特殊功能在DNA的末端加尾。第43页,课件共53页,创作于2023年2月第44页,课件共53页,创作于2023年2月2)黏性末端修饰成互补粘端或平末端后进行连接基本原理:
采用两种方法①修平:用核酸酶切除双链DNA分子的突出核苷酸,修平后用T4连接酶作平末端连接。②补平:用Klenow酶将粘端补平,产生平末端或匹配粘端,再用T4连接酶进行连接。第45页,课件共53页,创作于2023年2月第46页,课件共53页,创作于2023年2月
HindIII↓
↓XbaI
5’----ACTAGA----3’
3’----TTCGA
T----5’ dATP dTTPKlenowdGTPdCTPKlenow5’----AAG
CTAGA----3’3’----TTCGA
TCT----5’
T4DNAligase
5’----AAGCTAGA----3’3’----TTCGATCT----5’
图HindIII,XbaI酶切粘端的补平和连接第47页,课件共53页,
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