比色法和分光光度法

§16-1概述。§16-2光吸收的基本定律。§16-3比色法和分光光度法及其仪器§16-4显色反应与显色条件的选择。§16-5分光光度法仪器测量误差及其消除§16-6分光光度法的某些应用。

教学内容第十六章比色法和分光光度法1化学分析法酸碱滴定法配位滴定法氧化还原滴定法沉淀滴定法重量分析法容量分析法仪器分析－－比色法和分光光度法2利用溶液颜色的深浅来测定溶液中有色物质的浓度，这种测定方法称为比色分析法。用分光光度计进行的比色分析的方法称为分光光度法。§16-1概述目视比色,称为比色法。3

—灵敏度高：测定下限可达10－5～10－6mol/L,10-4%～10-5%准确度高一般吸光光度法的相对误差为2-5%，对微量成分来说，还是比较满意的，因为在这种情况下，滴定分析法和重量法也不够准确了，甚至无法进行测定。操作简便快速应用广泛:几乎所有的无机离子和有机化合物都可直接或间接地用吸光光度法进行测定。16-1-1光度分析法的特点

41、光的基本性质

光具有波粒二象性，即波动性、粒子性。根据波长的不同，可分为：p396

紫外光区：200nm～400nm

可见光区：400nm～750nm

红外光区：750nm～1000μm描述其波动性的主要参数是：波长λ，频率γ

，光速C。三者间关系为：λγ＝C16-1-2物质对光的选择性吸收5具有同一波长的光称为单色光。光的粒子性：如光电效应。光子的能量（E）决定于光的频率和波长：不同波长组成的光称为复合光。白光（如日光）是复合光，是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等光按适当的强度比例混合而成的，在400nm～750nm范围的一种复合光。62、物质对光的选择性吸收物质为什么有颜色，其实质是什么？--物质本性、光7互补色光如KMnO4吸收绿色光，因此KMnO4溶液呈现紫色。物质的颜色8

将不同波长的光透过某一固定的溶液，测量不同波长下溶液对光的吸光度，作图得到光吸收曲线,描述物质对不同波长光的吸收。400480560640720λnm0.40.81.21.6AKMnO4溶液的吸收曲线DCBA

A、B、C、D代表不同浓度下的吸收曲线。3吸收曲线λmax9IrIoItIa

一束平行单色光照射透明溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被器皿的表面反射。16-2-1朗伯-比尔定律§16-2光吸收的基本定律1、朗伯—比尔定律10Io=Ia

+It+Ir

若入射光强度为Io，吸收光的强度为Ia，透过光强度为It，反射光的强度为Ir，它们的关系是：

在吸光光度法中，测定时都是采用同样质量的比色皿，反射光的强度基本上是不变的，其影响可以相互抵消。空白调零。分光光度法中：

Io=Ia

+It11从上式可以看出：

溶液的透光度愈大，说明溶液对光的吸收愈小，相反，透光度愈小，说明溶液对光的吸收愈大.透光度:透过光强度It与入射光强度Io之比,用

T表示吸光度：用A表示12比例常数，与、c、T有关。b：溶液厚度朗伯定律：当、c、T一定时，溶液的吸光度与液层的厚度成正比。比尔定律：当、b和T一定时，溶液的吸光度与溶液的浓度成正比。13

朗伯—比尔定律（同时考虑溶液浓度和液层厚度的影响）一束平行单色光通过溶液，当和T一定时，其吸光度与溶液的浓度和液层厚度成正比。朗伯-比尔定律的适用条件(1)单色光:应选用max处或肩峰处测定(2)吸光质点形式不变：离解、络合、缔合会破坏线性关系，应控制条件(酸度、浓度、介质等)(3)稀溶液：浓度增大，分子之间作用增强14

当c用g·L-1表示，b用cm表示时，K用a表示，称为吸光系数，其单位为

L·(g.cm)-1

，则：2、比例常数K①吸光系数aA=abc②摩尔吸光系数κ

c用mol·L-1表示，b用cm表示时，K用κ表示，称为摩尔吸光系数，其单位为L·(mol.cm)-1。则：A=κbcκ在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。15κ越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。

κ>105：超高灵敏；

κ=(6～10）×104

：高灵敏；

κ<2×104：不灵敏。桑德尔(Sandell)灵敏度(灵敏度指数)用S来表示。

S是指当仪器的检测极限A=0.001时，单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含量，其单位为μg·cm-2，S与κ及吸光物质摩尔质量M的关系为：S=M/κ分光光度的灵敏度16【例】：有一浓度为1.0g/mlFe2+的溶液，以邻二氮菲显色后，在比色皿厚度为2cm、波长510nm处测得吸光度为0.380，计算（1

）透光度T；(2)吸光系数a；（3）摩尔吸光系数κ

。解（1）T＝10-A＝10-0.380＝0.417

（2）（3）1716-2-2吸光度的加合性A总

=∑Ai=κ1b1c1+κ2b2c2+……κnbncn

总的吸光度等于各个吸光物质的吸光度之和。或溶液的吸光度应等于溶液中各组分的吸光度之和。（组分间没有干扰）A4A3A2A118溶液中多组分测定1916-2-3对朗伯-比尔定律的偏离

一、物理因素：

1、单色光不纯，导致负偏差。CA标准工作曲线图正误差负误差2、散射光的影响，胶体、乳浊液或悬浊液由于散射的作用使吸光度增大，或入射光不是垂直通过比色皿产生正偏差。20二、化学因素1、吸光质点的相互作用，浓度较大时，产生偏差，

朗伯-比尔定律只适合于稀溶液（c<10-2mol·L-1)。2、平衡效应，物质的离解、缔合、互变异构及化学变化引起的偏离，如：

Fe(SCN)3=Fe3++3SCN-Cr2O72-+H2O=2CrO42-+2H+

21一、目视比色法：用眼睛比较溶液颜色深浅以确定物质含量。（也叫标准色阶法）12345

标准系列溶液待测溶液§16-3比色法和分光光度法及其仪器22目视比色法的优点是：1、仪器简单，操作简便，适宜于大批试样分析。2、测定的灵敏度较高，适宜于稀溶液中微量元素的测定。3、

白光下进行测定，因此有些显色反应不符合朗伯——比耳定律时，仍可用目视法测定。目视比色法的缺点是：1、有色溶液一般不太稳定，常常临时配制一套标准色阶，较麻烦费时。2、依靠人的眼睛来观察颜色深度，有主观误差，准确度不高，相对误差约为5～20%。23二、分光光度计

(spectrophotometer)通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.波长可调,故选择性好,准确度高.光源单色器吸收池检测系统稳压电源分光光度法的基本部件：读数指示器24分光光度计内部光的传播途径251.光源(Lightsource)：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,稳定。 可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm)

紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)2.单色器(monochromator)：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。棱镜

光栅

玻璃350～3200nm,石英185～4000nm263.吸收池(cell):用于盛待测液及参比溶液。玻璃—能吸收UV光，仅适用于可见光区石英

—不吸收紫外光，适用于紫外和可见光区要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）4.检测器(detector)：利用光电效应，将光能转成电流讯号。 光电池，光电管，光电倍增管275.读数指示器读数指示器的作用是把光电流放大的信号以适当方式显示或记录下来。通常使用悬镜式光电反射检流计测定产生的光电流。检流计光点偏转刻度直接标为吸光度和透光率，测定时一般可直接读出吸光度。2816.4显色反应与显色条件的选择显色反应在分光光度分析中，利用显色反应把待测组分M

转变为有色化合物MR，然后再进行测定。使试样中的被测组分与化学试剂作用生成有色化合物的反应叫显色反应。所用试剂称显色剂。M(待测物)＋nR(显色剂)＝MRn(有色化合物)

显色反应主要有配位反应和氧化还原反应，其中绝大多数是配位反应。2916-4-1对显色反应的要求1、灵敏度高，选择κ较大的显色反应。避免共存组分干扰。2、选择性好，显色剂只与被测组分反应。3、有色物组成固定，如：Fe3++磺基水杨酸→三磺基水杨酸铁(黄色)

（组成固定）Fe3++SCN-→FeSCN2+、Fe(SCN)2+……

（组成不固定）304、有色物稳定性高，其它离子干扰才小。如三磺基水杨酸铁的Kf

=1042,F-

、H3PO4

对它无干扰。5、显色过程易于控制，而且有色化合物与显色剂之间的颜色差别应尽可能大。31cRcRcR16.4.2显色反应条件的选择（实验确定）1、显色剂的用量

，适当过量。适宜的用量通过实验求得(cM、pH一定)322、酸度（cM、cR一定）pH1<pH<pH2pH333、显色时温度和时间T1(℃)T2(℃)t(min)A4、溶剂的影响，有机溶剂会降低有色物的离解度，从而提高显色反应的灵敏度。34(3)改变干扰离子价态，测Ni2+时，Fe2+

有干扰，加入氧化剂，Fe2+→Fe3+.(4)分离干扰离子，用萃取、沉淀、电解、离子交换等方法。还可选择适当的参比溶液和入射光的波长等方法来消除共存离子的干扰。(2)加入掩蔽剂

，如用SCN-测定Co2+时，Fe3+有干扰，加入F-:Fe3++6F-=FeF63-

;Fe3+

被掩蔽。

5、干扰物质的影响及消除(1)控制酸度，使干扰离子不显色。35§16-5分光光度法仪器测量误差及其消除

16-5-1入射光波长的选择。（545nm）最大吸收，最小干扰3616-5-2光度计读数范围的选择透光率读数的准确度是仪器精度的主要指标。测定结果的精度常用浓度的相对误差dc/c表示。37若透光率刻度的读数的绝对误差为∆T=1%，用不同的T代入上式，可得相应浓度测量的相对误差∆c/c，作图。0.20.40.60.81.00246810T0.368382、T在10%～70%(A=1.0～0.15)范围，相对误差较小。1、T=36.8%(A=0.4343)，相对误差最小。由图可见：为了减小浓度的相对误差，提高测定的准确度，一般应控制溶液吸光度A在最适宜读数范围1.0～0.15。39(1)试样、试剂、显色剂都无色时，用纯水作参比。(2)试样无色，试剂、显色剂有色，采用不加试样的空白溶液作参比。√（试剂空白）(3)试样有吸收，而显色剂等无色，可采用不加显色剂的试样为参比。（试样空白）(4)均有色，有吸收，对试样加入掩蔽剂，褪色后再加显色剂等作为参比。(褪色空白)16.5.3参比溶液的选择

在吸光度测量中，作为比较的溶液或溶剂称为参比溶液或空白溶液。40原理：朗伯—比尔定律（A=κbc）方法：（1）标准曲线法或工作曲线法（2）比较法16.5.4溶液浓度的测定41

先配制一系列标准溶液，在最大吸收波长处，测出它们的吸光度，作图，同条件下测未知液的吸光度，从图中查出未知液的浓度。cA工作曲线图Axcxc1c2c3c4c5A1A2A3A4A51、工作曲线法42同条件下分别测定未知液与标准溶液的吸光度Ax和A标，根据朗伯-比尔定律，应有下式：2、比较法因为：所以：4316.6分光光度法的某些应用16-6-1

单组分测定（1）金属离子:Fe-phen,Ni-丁二酮肟,Co-钴试剂（2）磷的测定:DNA中含P～9.2%,RNA中含P～9.5%,可得核酸量.H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O磷钼(Ⅵ)黄(κ小)磷钼(V)蓝(κ大)Vc4416-6-2多组分的测定

κxl1,κyl1,κxl2