核酸印迹与分子杂交

分子生物学技术

高颖gaoying822@

核酸印迹技术与分子杂交NucleicAcidBlottingandMolecularHybridization

核酸分子杂交（nucleotidemolecularhybridization）以DNA的变性、复性为理论基础；指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程。

Southern印迹（Southernblot）基本操作过程待测DNA样品制备、基因探针标记；待测DNA样品的电泳分离；电泳分离的DNA经变性、转移、固定到合适的固相支持物；特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交，放射自显影或显色检测目的DNA的存在。

Southernblot基本流程电泳 转移杂交，显影酶切DNA样品上样 DNA印迹重物Southern

blot关键步骤

待测DNA样品的酶切消化基因组DNA进行消化，才能在电泳过程中将不同长短的DNA片段分离开。

基因探针的标记

探针序列和探针信号的选择。要考虑特定基因的重复性、保守性和稳定性。可用同位素和非同位素标记。

Northern印迹（Northernblot）是将RNA从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，定性分析mRNA的常用方法。注意事项：RNA易被酶降解。可用于分析基因转录水平的变化。Westernblot（蛋白免疫印迹）技术

是将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶中转印到化学合成膜的支撑物上，利用特异性抗体进行反应，定性分析蛋白质。

用于分析基因表达(蛋白水平）的变化。原位分子杂交技术利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术。

组织、细胞或染色体的固定；探针；与探针结合的标记物；

可用于基因及其表达产物的定位分析。

聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction

聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；由K.Mullis于1983年建立；1999年获诺贝尔化学奖。可用于分析基因及其产物的水平变化；可进行实时、定量分析；

PCR体系模板引物耐热DNA聚合酶dNTPs含Mg2+的缓冲液

PCR的过程变性(Denaturing)

95℃DNA模板变性成为单链，引物自身和引物间的局部双链消除退火(Annealing)

引物与模板DNA杂交，Tm值减5℃延伸(Extension)

DNA聚合酶在72℃催化DNA的合成ingPCR技术的工作原理17PC借R技术PC兵R分析灰已知讲基因远；反转罢录PC差R（re馆ve谢rs岁e趴tr磁an泛sc选ri崇pt华io豆n隔PC捷R，RT翅-P贤CR）是将RN置A的反歪转录饼和PC晚R联合切应用征的一堵种技烧术。RT牵-P怜CR是从涂组织把或细篮胞中烤获得梯目的蛙基因甚及对画已知陷序列墨的RN盏A进行黑定性代及半弦定量谅分析进的有脖效方伪法。RT协-P渡CR与PC延R区别模板少为mR扇NA需逆拜转录蚕酶产物部为cD唤NA19mRNA5AAAAAA(n)3mRNA5AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5mRNA5cDNA3AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5oligo(dT)12-18反转录酶RNaseHDNA聚合酶S1核酸酶3cDNATTTTTT(n)5AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5反转桶录合睡成cD训NA实时损、定香量PC立R技术在PC揪R反应渔体系浙中加迷入荧光沙基团，利璃用荧日光信执号积每累实谷时检都测整届个PC阳R进程旷。通辛过标猛准曲杆线对僚样品堪中的DN陷A的起千始浓深度进予行定衡量的御方法午。特点掉：对DN忽A/奇RN怖A模板葵定量姿，灵策敏度代强，怕特异臭性高姻。21实时嫁、定懒量PC乳R技术QR3'3'5'5'上游居引物下游裹引物荧光虾标记干引物RQ3'3'5'5'DN煮A序列醉测定DN包A盼Se范qu劈燕en剑ci承ngDN拦A序列塌分析顷方法双脱耍氧链汇终止洗法利用2′，3省′-双脱非氧核绸苷酸闭掺入匀中，终止妈化学焰反应化学纽奉裂解切法利用乞化学胃试剂巧裂解服修饰晒碱基招终止聚桌合反骑应戊羊糖（RNA）1´2´3´4´5´核糖(ribose)（DNA）脱氧核糖(deoxyribose)DN罪A的序胃列测涛定5′端3′端CGA26双脱州氧链雁终止题法dADN以A自动浸测序用不注同荧光充分子筝标记局四种节双脱即氧核农苷酸，然蚀后进主行Sa缠ng胖er测序被反应出，反索应产寨物经性电泳防分离漏后，巨通过蝇四种披激光酷激发个不同柜大小DN膜A片段控上的寇荧光浅分子获使之泼发射炎出四贡种不妖同波哲长荧疫光，声检测宜器采尾集荧裁光信圣号，甩并依牲此确江定DN继A碱基筛的排建列顺辞序。DN渗A序列鲜自动疗分析dd贸G红dd叼Tdd举A绿dd导C蓝橙毛细垫管电雅泳荧光由标记DN愤A合成测序眼结果撕展示DN木A自动愈测序化结果嫁举例DN樱A序列堡分析缠可以抄揭示债基因太和基因测组一级飘结构变化通过DN泊A序列下分析酸可以车鉴定区基因澡和基可因组采的变话异通过DN赔A序列检测定里分析拴人工肿重组鱼的基烫因通过DN景A序列本测定鼠对定后点突笋变进葛行确柜认DN垦A芯片职技术DN期A范Ch有ip何T左ec嚼hn乳ol佩og贺ie婆sDN醉A芯片（DN莫A沉ch信ip）也称DN芝A微阵执列(D葡NAmi匪cr练oa螺rr勤ay)在固妻相支倾持物下上有翠序固贫化寡狂核苷艺酸或DN黑A探针开，与傲待测从荧光趟标记恭样品鄙进行肚杂交烤；通过好对杂亮交信渣号的励检测强、比层较和澡分析肃，得忧出样呜品的进遗传谅信息运；包括cD睡NA芯片秀和寡剪核苷燃酸微侍阵列基因赚芯片府工作佣流程DN挂A芯片裁技术cD讯NA芯片探针轧是cD臭NA片段胡，可旺以同滨任何预具有扎同源细序列章的样泥品形筑成杂旬交体封，同吐时定捎量监逢测大狸量基脱因的锹表达诱。寡核役苷酸砍芯片基因哨特异鞋的寡影核苷冤酸片欠段为探探针窗，对胡低丰肝度基陆因表民达水裕平变替化的狗检测抖具有便高度双灵敏任性。可进因行高负通量员基因男转录石活性移的分倚析DN要A芯片协技术筐的特带点快速、高效、敏感、平行绢化、自动立化。通过档芯片伐技术同筛选缎得到束的表造达信散息还烧要用Nor芽th蚀er朱n数bl垦ot或定水量RT激-P俯CR进行易验证DN陶A芯片眼技术臂的应化用肿瘤爆基因努表达迈谱的拒差异绕研究适；基因芒多态何性分颈析；微生锄物筛税选鉴丸定；遗传早病产峡前诊膝断等蛋白俊质芯疏片和帮组织跟芯片蛋白套质芯仓片蛋白歇质检售测芯群片蛋白车质功办能芯批片组织姨芯片是以柔形态沙学为暗基础育进行学高通椅量检撞测基诵因表圆达信埋息的零芯片捕技术蛋白藏质芯湖片技术狱优势在蛋脊白质村结构、功能岔和相响互作筑用，收以及疾病衫发展丘过程件中蛋溪白表艘达谱坐差异录研究旋等方面。在临要床医捞学研锡究中从，利阻用蛋攻白质变芯片柱技术寻撕找新咳的肿瘤泰标记蹈物，各霸种