酶工程酶的别构效应

酶工程酶的别构效应演示文稿目前一页\总数七十一页\编于六点优选酶工程酶的别构效应目前二页\总数七十一页\编于六点酶的别构效应本章中将讨论一些不符合米氏方程的酶动力学，即非双曲线动力学。有些影响酶活性的效应剂（包括激活剂和抑制剂）作用于酶活性部位以外的部位，通过酶分子构象的改变来调节酶的活性。这种效应叫做别构效应（allostericeffects），这种效应剂叫做别构效应剂，受别构效应剂影响的酶叫别构酶（allostericenzyme）。

目前三页\总数七十一页\编于六点一、别构酶与代谢调节生物体内的物质代谢都是在酶的直接作用下进行的，要使物质代谢协调有序地进行，酶活性必须根据情况适时地改变。利用别构效应调节酶活性是各种酶活性调节方式中最迅速的一种，大多数代谢物的反馈抑制就属于别构调节，也有一些代谢物可对代谢途径中的酶起别构激活作用。

目前四页\总数七十一页\编于六点1．别构抑制作用反馈抑制可分为五种类型：①线性通路中的反馈抑制一条途径的最终产物抑制途径中起始酶的活性。E1目前五页\总数七十一页\编于六点别构抑制作用②趋同通路中的反馈抑制

为了有效地合成D，要求B和C的浓度大致相等。当C浓度大时，对产生B的途径的最初的酶有激活作用；当B浓度大时，对产生B的途径的最初的酶有抑制作用。目前六页\总数七十一页\编于六点别构抑制作用③

趋散通路中的反馈抑制

EC和ED为两种同工酶，分别受C和D的反馈抑制。当C太多时，不仅抑制从B到C的第一个酶，而且抑制从A到B的第一个反应两种同工酶中的一种，使得B合成的速率下降。B的合成不能完全停止，因为合成D还需要B。当D太多时情况相似。

目前七页\总数七十一页\编于六点别构抑制作用④

顺序反馈抑制

一条途径中有多个反馈抑制步骤。

⑤

协调反馈抑制

需要多种代谢物共同作用才能发挥反馈抑制作用。

目前八页\总数七十一页\编于六点2．别构激活作用当一种代谢物积累后，激活某些酶，从而加强别的代谢途径。如有氧呼吸旺盛时，ATP大量合成，AMP和ADP减少，由于AMP和ADP是异柠檬酸脱氢酶的激活剂，因此异柠檬酸和柠檬酸浓度增高，柠檬酸能激活乙酰CoA羧化酶和己糖激酶，同时抑制PFK（磷酸果糖激酶）。激活乙酰CoA羧化酶可增强脂肪酸的合成，激活己糖激酶且抑制PFK，可使G-6-P更多地进入磷酸戊糖途径，合成更多的NADPH，供脂肪酸合成使用。

目前九页\总数七十一页\编于六点二、别构酶的基本概念1．一个典型的别构酶——天冬氨酸转氨甲酰酶天冬氨酸转氨甲酰酶（aspartatetrans-carbamoylase,ATC）是嘧啶核苷酸生物合成途径的第一个酶（→

→

→

UTP→CTP）。目前十页\总数七十一页\编于六点天冬氨酸转氨甲酰酶

ATC的活性受到CTP的强烈抑制，又受到ATP的高效激活。效应剂

抑制%嘧啶族

胞嘧啶0胞嘧啶核苷24胞苷一磷酸（CMP）38胞苷二磷酸（CDP）68胞苷三磷酸（CTP）86尿苷三磷酸（UTP）8嘌呤族

鸟苷三磷酸（GTP）35腺苷三磷酸（ATP）-180（激活）目前十一页\总数七十一页\编于六点天冬氨酸转氨甲酰酶在对照、加ATP、加CTP三种情况的V对[S]图中可以看出，对照呈S形曲线而不是双曲线；加ATP减小了反应的表观Km值，使曲线向双曲线靠近；加CTP增大了反应的表观Km值，使曲线的S形更加明显。加ATP和CTP并不影响Vm。

目前十二页\总数七十一页\编于六点天冬氨酸转氨甲酰酶目前十三页\总数七十一页\编于六点ATC的结构与功能为了解释这种现象，研究者设想在酶分子中有两个分开的部位，一个部位与底物结合并催化反应，另一个部位是ATP或CTP等效应剂的结合位点。利用选择性修饰法修饰后一个部位后，ATC的活性并不丧失，但对CTP抑制的敏感性下降，这种现象称为脱敏作用。选择性修饰实验证实了两个部位的设想。现在我们知道，ATC由12条多肽链组成，2个α3亚基，3个β2亚基。

目前十四页\总数七十一页\编于六点ATCase的亚基结合方式rrcc目前十五页\总数七十一页\编于六点ATC的特点

根据对ATC的研究，得出了5点结论：①酶分子上有两个结合部位，结合底物并催化反应的部位叫活性部位，结合效应剂的部位叫别构部位或调节部位。②这两个部位能同时分别被底物和效应剂占据。③调节部位可与多种效应剂结合，并产生不同的效应。④效应剂的结合影响酶分子的构象，从而影响酶与底物的结合能力和催化能力。⑤

调节部位的效应是构成别构抑制或别构激活的基础，而后两者又是代谢调节的有效方式之一。

目前十六页\总数七十一页\编于六点2．别构酶的协同效应协同效应（cooperativeeffects）也是多亚基别构酶的一个特征。能与酶结合的底物、激活剂和抑制剂统称配体，所谓协同效应是指当一个配体与酶结合以后，可以促进或抑制另一个配体与酶结合。

目前十七页\总数七十一页\编于六点（1）协同效应的分类①

同种效应和异种效应

同种效应（homotropiceffects）指的是一分子配体与酶结合后影响另一分子同种配体与酶的结合；异种效应（heterotropiceffects）指的是一分子配体与酶结合后影响另一分子异种配体与酶的结合。

目前十八页\总数七十一页\编于六点协同效应的分类②正协同和负协同

一分子配体与酶结合后促进另一分子配体与酶结合叫正协同（positivecooperation），抑制另一分子配体与酶结合叫负协同（negativecooperation）。同种效应一般是正协同；异种效应有正协同，也有负协同。

目前十九页\总数七十一页\编于六点（2）协同效应的鉴别方法通过动力学作图，可以鉴别底物之间的正协同、负协同和无协同。

目前二十页\总数七十一页\编于六点动力学作图法鉴别协同效应目前二十一页\总数七十一页\编于六点（3）协同指数和协同系数

协同指数（cooperativeindex，CI）是指酶的底物结合位点被底物饱和90%和饱和10%（即V=0.9Vm和V=0.1Vm）时的底物浓度之比，故协同指数又称饱和比值（Ratiosaturation，Rs）。目前二十二页\总数七十一页\编于六点

对于一个可结合n个底物分子的酶，其反应式可用下式表示：按米氏方程的推导过程可得式中这里假设n个底物是同时结合上去和同时解离下来的。

协同系数…………①return目前二十三页\总数七十一页\编于六点协同系数当V=0.9Vm

时，[S]0.9=

；当V=0.1Vm时，[S]0.1=

。

CI=Rs==目前二十四页\总数七十一页\编于六点协同系数n的意义因此，当n＝1时，CI＝81，和以前讲过的单底物单产物反应的米氏方程相同，无协同效应。当n>1时，CI<81，为正协同，表示V对[S]改变的灵敏度增加，且n越大正协同效应越大；当n<1时，CI>81，为负协同，表示V对[S]改变的灵敏度减小，且n越小负协同效应越大。n值即为协同系数。

CI=Rs==目前二十五页\总数七十一页\编于六点n值的理论错误从理论上推导上式时，n是与酶结合的底物分子数，但实际上测出的n值（测定方法见后）有小于1的情况。上面说的n

>1、n＝1、n<1指的是实际测定值，这是因为推导上式时的前提就不正确，n个底物并不是同时结合上去和同时解离下来的。

目前二十六页\总数七十一页\编于六点别构效应剂对n值的影响别构激活剂常可减少正协同效应（底物和底物之间的正协同）的n值，使正协同效应减弱，在V对[S]作图中，可使S形曲线趋向双曲线。相反，别构抑制剂常可增加正协同效应的n值，使正协同效应增强，使S形曲线弯曲更加明显。

目前二十七页\总数七十一页\编于六点（4）半位反应性兔肌和细菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶由4个同种亚基组成，每个亚基上有1个NAD+结合位点，但实验结果发现该酶往往只能结合2个NAD+分子，这就是半位反应性。半位反应性实际上是一种极端的负协同效应，当第一、二个NAD+与酶结合后，第三个结合位点与NAD+的亲和力已降得很低，实际上已不能与NAD+结合。

目前二十八页\总数七十一页\编于六点（5）协同效应的生理意义异种协同效应分为别构激活（异种正协同）和别构抑制（异种负协同）效应。它们的意义就是通过效应剂与酶结合来激活或抑制酶的活性，从而调节代谢速率。

异种协同效应的生理意义目前二十九页\总数七十一页\编于六点协同效应的生理意义正协同效应提供了一个V对[S]的敏感区域，即S形曲线中的“陡段”，当细胞内底物浓度处于这个“陡段”时，[S]的轻微变化可使V发生很大的变化，有稳定[S]的作用。当细胞内底物浓度处于低[S]的平缓段时，[S]的变化不会使V有太大的变化，有稳定V的作用。别构激活剂和别构抑制剂可使“陡段”左移和右移。底物引起的同种正协同效应

目前三十页\总数七十一页\编于六点协同效应的生理意义底物引起的同种负协同效应在更大的[S]范围里使V稳定，如3-磷酸甘油醛脱氢酶在低NAD+浓度时，能顺利地进行糖酵解，而当其他反应影响使NAD+浓度增加时，即使大幅度地增加NAD+（100倍以内），都可因其半位反应性而不增加酶反应速度。底物引起的同种负协同效应

目前三十一页\总数七十一页\编于六点3．别构酶的其他动力学术语①S0.5

前面①式中的KS’=[S]n时，。由于别构酶不符合米氏动力学，我们将时的底物浓度称为表观

Km

或

S0.5

。

前面的①式目前三十二页\总数七十一页\编于六点别构酶的其他动力学术语②

K型效应剂和V型效应剂

在别构效应剂中，只影响表观Km（或者说S

0.

5）的效应剂称为K型效应剂，它们与竞争性抑制剂的效应相似；竞争性抑制剂只会使Km增大，而K型效应剂根据其是激活还是抑制，分别使S

0.

5降低和升高。只影响Vm的效应剂称为V型效应剂，它们与非竞争性抑制剂的效应相似；非竞争性抑制剂只会使Vm下降，而V型效应剂根据其是激活还是抑制，分别使Vm升高和降低。目前三十三页\总数七十一页\编于六点4．别构酶的通性①由多个亚基组成，亚基可以是同种或异种。②有调节部位和催化部位。③可结合多个配体。④配体的结合有协同效应，一分子配体与酶结合后使酶的构象改变，从而影响下一分子配体的结合。⑤根据CI值或n值可鉴别协同效应的类型。⑥

其V对[S]的曲线不是双曲线，而是S形曲线（正协同）或“表观双曲线”（负协同）。

目前三十四页\总数七十一页\编于六点三、别构机制的模式1．Hill模式2．Adair模式3．MWC模式4．KNF模式目前三十五页\总数七十一页\编于六点1．Hill模式

Hill模式是Hill在1909年提出来的，当时是试图解释O2与血红蛋白结合的S形曲线的，后来用于别构酶反应中。以下是求Hill系数n值（协同系数）的方法：

式中

…………③设酶被底物饱和的分数为，则

…②目前三十六页\总数七十一页\编于六点求n值的方法由②得

…④将④代入③得

…②…………③目前三十七页\总数七十一页\编于六点求n值的方法，，…⑤∵

，代入⑤式得

目前三十八页\总数七十一页\编于六点求n值的方法以对作图，可得一直线，其斜率为n，纵轴截距为，横轴截距为lgS

0.

5

。目前三十九页\总数七十一页\编于六点求n值的方法当[S]过高或者过低时（[S]>[S]0.9或[S]<[S]0.1），n常等于1，故在一个广泛的[S]范围内作图时，得到的是折线。目前四十页\总数七十一页\编于六点n值与底物结合位点数的关系

Hill模式忽略了ES，ES2，…ESn-1等形式的存在，由于协同效应和前述忽略不饱和结合形式的影响，根据Hill作图计算出来的n值往往小于酶对底物的结合位点数，Hb（hemoglobin，血红蛋白）上有4个O2结合位点，但计算的结果是n＝2.6～2.8。在负协同效应中，每分子酶也结合n个底物，但计算的结果却是n

<1。所以Hill系数只能作为鉴别协同性的指标。

目前四十一页\总数七十一页\编于六点2．Adair模式

Adair模式允许有稳定的未被底物饱和的ESx复合物存在。对于一个有4个底物结合位点的酶，有

其中K1、K2、K3、K4实际上是微观或内在解离常数（microscopicorintrinsicdissociationconstants），如果4分子底物是分别结合在四聚体酶的4个亚基上，则4个表观解离常数（apparentdissociationconstants）为：

目前四十二页\总数七十一页\编于六点微观解离常数与表观解离常数的关系取上面第二式证明如下：

目前四十三页\总数七十一页\编于六点Adair模式的速度方程………⑥目前四十四页\总数七十一页\编于六点将5种酶存在形式的浓度表达式代入⑥式得

分子分母同乘以得

………⑦目前四十五页\总数七十一页\编于六点如果酶分子中4个底物结合位点是相同的，并且它们之间没有相互作用，无协同性，则内在解离常数K1=K2=K3=K4，可用Ks统一表示它们，因此

将这4个表达式代入⑦式得

分子分母同除以得

目前四十六页\总数七十一页\编于六点分子分母同除以得

目前四十七页\总数七十一页\编于六点∵

，

∴，与米氏方程相同。如果每一底物结合位点的内在解离常数不同时，就会出现协同性。K1>K2>K3>K4是正协同性，K1<K2<K3<K4是负协同性。

目前四十八页\总数七十一页\编于六点∵

，∴

时

，即

余相似，,

在这些条件下就会导致正协同性。同理可得出负协同性的关系式。

Adair模式正负协同性的判断目前四十九页\总数七十一页\编于六点3．MWC模式

1965年，Monod，Wyman和Changeux提出了一个根据酶的构象变化来说明协同效应的分子模式，MWC模式即以他们3人的姓缩写命名。根据此模式的特点，又称为齐变模式（concertedmodel）。此模式规定了以下几点：①

别构酶是寡聚酶，由同种亚基组成，这些亚基称为原体（protomer），它们在寡聚体中占有均等的地位。②一个原体对一种配体只有一个结合位点。

目前五十页\总数七十一页\编于六点MWC模式的规定③原体有两种构象状态，分别为R型（relaxed，松弛态）和T型（tensed，紧张态），这两种状态在与底物的亲和力、对别构效应剂的反应、催化活力方面可以不同，同一种状态的原体在这些方面是相同的。④在一个寡聚体中，所有的原体均处于同一种构象。各原体构象的转变是同步的，在一个寡聚体中，不存在R型和T型的杂合体。⑤

R型和T型之间有一个转换平衡。

目前五十一页\总数七十一页\编于六点（1）底物同种协同效应（以4聚体为例）目前五十二页\总数七十一页\编于六点MWC模式的速度方程（推导略）式中n等于一个寡聚体中的原体数，在上例中n＝4。

设，，则。

目前五十三页\总数七十一页\编于六点讨论①

当L无穷小时，体系中只有R型，。②当L无穷大时，体系中只有T型，。③当时，（两种内在解离常数相等），目前五十四页\总数七十一页\编于六点讨论④

因为R型对底物的亲和力恒大于T型，所以值不可能大于1，C可在0～1之间取值。当C

=

1时无协同效应；当C=0时正协同效应最大。C越小正协同效应越大。⑤L越大正协同效应越大。

目前五十五页\总数七十一页\编于六点MWC模式的Ys对α作图（不同C值）目前五十六页\总数七十一页\编于六点MWC模式的Ys对α作图（不同L值）目前五十七页\总数七十一页\编于六点某些别构酶（别构蛋白）的别构常数别构蛋白配体结合位点数Hill系数LC血红蛋白O242.83×1050.01酵母丙酮酸激酶磷酸烯醇式丙酮酸42.89×1030.01酵母3-P-甘油醛脱氢酶NAD+42.3600.04目前五十八页\总数七十一页\编于六点（2）MWC模式的异种协同效应假设底物优先与R型结合，别构激活剂A也优先与R型结合，则A的存在可使R和T之间的平衡偏向R型，即L值降低，提供更多的R型供底物结合用，使Ys上升，表现出激活效应，同时底物正协同效应减弱。如果A与R型的结合不改变R型的催化效应，也不改变KR，则A为K型激活剂。

目前五十九页\总数七十一页\编于六点MWC模式的异种协同效应

相反，K型抑制剂I优先与T型结合，使L值上升，T型增加，Ys降低，表现出抑制作用，同时底物正协同效应增强。

如果KR=KT，但R型有较高的催化效率，则与R型结合的A成为V型激活剂，与T型结合的I成为V型抑制剂。

MWC模式没有能够解释负协同效应。目前六十页\总数七十一页\编于六点4．KNF模式

1966年，Koshland，Nemethy和Filmer对Adair模式进行了扩展，提出了KNF模式，根据此模式的特点，又被称为序变模式（sequentialmodel）。其要点如下：①在底物或效应剂不存在时，酶的各个原体以同一种构象存在。

目前六十一页\总数七十一页\编于六点KNF模式的要点②

当底物与一个原体结合后，可引起此原体构象的变化，同时使邻近的原体改变对底物的亲和力；第二分子底物与第二个原体结合后，使第二个原体构象发生改变，同时又影响了剩余原体对底物的亲和力。

K1>K2>K3>K4（内在解离常数）为正协同效应，K1<K2<K3<K4为负协同效应。

目前六十二页\总数七十一页\编于六点四、引起非双曲线动力学的其他现象1．酶的记忆现象

有些单体酶能表现出S形曲线，这也是因为别构效应引起的。1967年Rabin提出酶——底物复合物能进行异构作用的机制来解释S形曲线。

ES必须先缓慢地异构成FS，然后快速地分解（breakdown）成F和P，F能够回复到E，也可以直接与S结合形成FS。

return目前六十三页\总数七十一页\编于六点酶的记忆现象引起S形曲线的机理在低浓度S时，酶主要以E和ES形式存在，产物形成速度被缓慢的异构化作用所限制。由于[S]低，F有较多的比例回复到了E，只有少量的F直接与S结合成FS。当[S]高时，有较多的F直接与S结合成FS，由于直接生成FS，避免了这个限速步骤，所以大幅度地加快了反应速度，从而表现出S形曲线。

反应式目前六十四页\总数七十一页\编于六点别构效应剂对记忆酶的影响别构激活剂与E结合后可以提高异构化速率，别构抑制剂则降低异构化速率。别构效应剂通过影响k4及k1’也会影响S形曲线的形状。

目前六十五页\总数七十一页\编于六点记忆酶举例

FS释放出产物后仍保持F构象可以认为是一种“记忆”现象。有记忆现象的酶称为记忆酶。记忆酶有单底物单产物的，也有双底物双产物的。动物肝脏中的葡萄糖激酶和大麦胚中的己糖激酶都是典型的记忆酶。

目前六十六页\总数七十一页\编于六点2．可引起正协同