版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领
文档简介
实验四
蔗糖酶活力测定
——3.5-二硝基水杨酸法一、实验目的和要求1、掌握酶活力测定的基本原理和方法;2、学习酶的比活力的计算。二、实验基本原理蔗糖酶(β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC3.2.1.26),是一种水解酶。它能催化非还原性双糖(蔗糖)的1,2-糖苷键裂解,将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖(还原糖)。因此,每水解1mol蔗糖,就能生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法,例如:纳尔逊-索模吉(Nelson-Smogyi)试剂比色法,斐林试剂法等。本实验采用3.5-二硝基水杨酸法测定还原糖的含量,由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5-二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物,在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。因此可利用分光光度计在520nm进行比色测定,求得样品中的含糖量。此法操作简便、迅速、杂质干扰较小。蔗糖酶活力单位(u):
蔗糖酶在50℃,pH4.5的条件下,每分钟水解产生1mg葡萄糖所需的酶量。蔗糖酶比活力的计算:酶的比活力——为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数,一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度,对于同一种酶来说,比活力越大,酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力,是表示酶的纯度高低的一个重要指标。
比活力——酶的总活力单位数除以总蛋白mg数,即每mg蛋白所含有的酶活力单位数。
比活力=活力单位/mg蛋白三、实验材料与试剂1、实验材料蔗糖酶样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ2、实验试剂①3,5-二硝基水杨酸试剂;甲液:溶解6.9g结晶酚于15.2ml10%NaOH溶液中,并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。乙液:称取255克酒石酸钾钠加到300ml10%NaOH溶液中,再加入800ml1%3,5-二硝基水杨酸溶液.
甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。②1g/L葡萄糖标准溶液(葡萄糖相对分子量198.17);③5%蔗糖溶液;④0.2mol/L乙酸缓冲液,pH4.5;四、实验器材与仪器1、恒温水浴(25℃、100℃);2、可见光分光光度计、1cm玻璃比色皿;3、试管、试管架;4、移液管;5、微量移液器:200μl、1000μl;五、实验操作方法和步骤(一)蔗糖酶活力的测定1、标准曲线的制作按下表加操作:
以还原糖(mg数)为横坐标,A520值为纵坐标,制作葡萄糖浓度-吸光值标准曲线。12345671g/L葡萄糖标准溶液(ml)0.000.200.300.400.500.600.70H2O(ml)2.01.801.701.601.501.401.303.5-二硝基水杨酸(ml)1.01.01.01.01.01.01.0
将各管溶液混匀后,在100℃恒温水浴加热5分钟,取出立即用冷水冷却至室温H2O(ml)7777777
将各管溶液混匀A520样品空白I(1:150稀释)Ⅱ(1:150稀释)Ⅲ(1:100稀释)Ⅳ(1:10-30)编号123456789101112130.2mol/L乙酸缓冲液(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5H2O(ml)1.00.950.80.50.950.80.50.950.80.50.950.80.5蔗糖酶液(ml)0.00.050.20.50.050.20.50.050.20.50.050.20.55%蔗糖溶液
(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5保温时间立即混匀后,50℃
保温10分钟,用冷水冷却至室温3.5-二硝基水杨酸试剂(ml)1111111111111在100℃恒温水浴中加热5分钟,用冷水冷却至室温蒸馏水7777777777777混匀A5202、蔗糖酶的酶活力测定按下表加样:体积(ml)蛋白浓度(mg/ml)总蛋白(mg)活力(u/ml)总活力u比活力u/mg样品Ⅰ样品Ⅱ样品Ⅲ样品Ⅳ(二)实验结果
1、蔗糖酶活力和
温馨提示
- 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
- 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
- 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
- 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
- 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
- 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
最新文档
- 屋顶光伏电站施工方案
- 屋面花架格栅施工方案
- 屋面专项施工方案
- 局部排风课程设计
- 高中数学 第一章 1.3.3函数的最大(小)值与导数同步检测 新人教A版选修2-2
- 少儿舞蹈表现力课程设计
- 小燕子戏剧表演课程设计
- 小学生心理建设课程设计
- 小区生化池施工方案
- 小主持人游戏课程设计
- 制造企业数字化转型诊断调查问卷(烟台市)
- 中小学教师职称制度改革人员过渡登记表
- 模拟联合国沙盘项目精编版课件
- 心内科晋升副主任(主任)医师专题报告一
- 发证机关所在地区代码表
- 自考04729大学语文总复习资料
- 四年级上册英语课件-Unit3 It's a pineapple. Lesson 15 人教精通版(共16张PPT)
- 社会调查与统计最全ppt完整版课件全套教学教程整本书电子教案
- 高三英语二轮复习专项之阅读理解“七选五”教学设计
- 风生水起博主的投资周记
- 四年级上册劳动与技术全册教案
评论
0/150
提交评论