双荧光素酶报告系统(5篇)

1/1双荧光素酶报告系统(必备5篇)双荧光素酶报告系统第1篇双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。海肾荧光素酶基因作为内参，将带有海肾荧光素酶基因的质粒与报告基因质粒共转染细胞；或是将两个报告基因构建到同一个质粒上，分别用不同的启动子启动其表达。计算结果时，将萤火虫荧光素酶的检测值比上海肾荧光素酶检测值（FireflyLuciferase/RenillaLuciferase），进而可以减少内在变化因素对实验准确性的影响，使测试结果不受实验条件变化的干扰。双荧光素报告基因可以避免单报告基因实验中受到各种实验因素的影响，因此近年来基于基因工程原理发展起来的报告基因技术逐渐成为最具有发展潜力基因分析工具之一。

双荧光素酶报告基因检测设计图及原理图示

双荧光素酶报告系统第2篇将启动子序列构建到萤火虫荧光素酶基因前，同时过表达转录因子。当转录因子与启动子上特异结合位点结合后激活荧光素酶基因转录，使萤火虫荧光素酶得以表达，最终荧光强度上升；当结合位点被突变后，转录因子无法与启动子结合，因此荧光值无明显变化。

原理简介-miRNA与靶基因

将靶基因序列构建到萤火虫荧光素酶基因3’区域，同时过表达microRNA。当microRNA与靶基因上特异结合位点结合后，将干扰荧光素酶mRNA的翻译或导致其迅速降解，使荧光强度降低；当结合位点被突变后，microRNA无法与靶基因结合，因此荧光值无明显变化。

其他应用

microRNA靶基因包括mRNA、lncRNA、circRNA。对于microRNA表达量较高的细胞，可以同时构建microRNA的inhibitor进行验证。

双荧光素酶实验的其他应用：

测其启动子的活性。

启动子SNP分析：一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，将待测启动子插入报告基因上游，检测萤光素酶活性，从而判断这些启动子的相对活性。

项目流程报价与周期

◎转录因子与启动子

◎microRNA与靶基因

文献分享

ThecircRNAcircSEPT9mediatedbyE2F1andEIF4A3facilitatesthecarcinogenesisand

developmentoftriple-negativebreastcancer.

期刊：Mol.CancerIF：

发表时间：20XX

TherelativeluciferaseactivitiesweredetectedinMDA-MB-231cellsco-transfectedwithluciferasereporterplasmidscontainingwildtypeormutantSEPT9promotersequenceandoverexpressionplasmidsofE2F1.

文章中双荧光素酶等实验由本公司和客户合作完成。

YY1-mediatedreticulocalbin-2upregulationpromotesthehepatocellularcarcinomaprogressionviaactivatingMYCsignaling.

期刊：AmJCancerResIF：

发表时间：20XX

SchematicillustrationofYY1bindingsiteonthewildtypeandmutantRCN2promotor.FluorescenceactivityinHuh7cellswithRCN2wildtypeandmutantpromotorwithYY1.

文章中双荧光素酶等实验由本公司和客户合作完成。

双荧光素酶报告系统第3篇在报告基因的5"端加上待检测基因的启动子，就可以用来检测转录因子对启动子的作用，启动转录越多，那报告基因的表达量就越大，荧光值越高。

◆启动子研究

将启动子区域序列进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建到luciferase报告载体中，检测其启动子活性。

◆信号通路研究

信号通路的激活/监测基因的表达水平。

三

双萤光素酶报告基因检测实验操作流程

报告基因检测流程主要有4个模块：分别是质粒构建、细胞转染、报告基因检测和数据分析。

质粒构建

双萤光素酶报告基因系统一般将萤火虫萤光素酶报告基因质粒和海肾萤光素酶报告基因质粒共转染细胞，或将这两个报告基因构建到同一个骨架质粒上（如pGL4质粒），分别用不同的启动子启动其表达。

◆主报告基因载体的选择

根据实验目的选择对应的载体骨架。

◆内参报告基因载体的选择

带有表达组成型启动子的萤光素酶表达载体作为内参。

◆转染细胞系选择

◆转染方法选择

◆转染报告基因比例

◆启动子和转录因子比例

◆核酸与转染试剂的比例

从1:2开始调整，另外，注意质粒的纯度、完整度和去内毒素。

报告基因检测◆检测试剂选择

◆检测板选择

◆检测仪器选择

检测时间：辉光型sec，闪光型2-10sec。

数据分析

通过仪器可以直接读出萤火虫和海肾萤光素酶的数值，两种荧光值读数不少于4位数，读数大于8位数时，需要稀释裂解上清（读数与细胞种类、细胞状态、转染方法、转染时间等因素相关）。

归一化值=萤火虫萤光素酶读值（主报告基因）/海肾萤光素酶读值（内参基因）

相对表达倍数=实验组归一化值/对照组归一化值

给大家举个例子：

写到这里，双萤光素酶报告基因检测系统的实验操作篇就给大家分享完了，大家对这个实验是否有更进一步的了解啦！如果您在实验操作过程中还有其他问题欢迎留言或来电咨询哦~

下期小翌将会结合大家的留言进一步分享~

最后小翌给大家分享一下Yeasen萤光素酶报告基因检测的解决方案，每一步都能帮到您！

双荧光素酶报告系统第4篇启动子Promoter：是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游,启动子本身不被转录。

转录因子Transcriptionfactors，TF：真核生物转录起始过程十分复杂需要多种蛋白因子的协助。转录因子与RNA聚合酶Ⅱ形成转录起始复合体，共同参与转录起始的过程。根据转录因子的作用特点可分为二类；第一类为普遍转录因子，在它们与RNA聚合酶Ⅱ共同组成转录起始复合体时，转录才能在正确的位置开始。第二类转录因子为组织细胞特异性转录因子，这些TF是在特异的组织细胞或是受到一些类固醇激素\生长因子或其它刺激后，开始表达某些特异蛋白质分子时，才需要的一类转录因子。

转染：细胞转染是指将外源分子，如重组质粒载体、游离核苷酸等物质，在导入真核细胞的实验技术，有显微注射、磷酸钙法、脂质体/聚合物法和电转法

双荧光素酶报告系统

荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在氧化的过程中会发出生物荧光（bioluminescence），用荧光测定仪（luminometer）或液闪测定仪测定luciferin来检测荧光，是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。转录因子的作用强度与荧光素酶的表达量成正比。

将待检测的调控元件（启动子）安排在荧光素酶基因的上游，构建成载体，然后将构建完成的载体导入到合适的动物细胞中，通过检测荧光素酶的活性来判断调控元件的活性。最常用到的就是双荧光素酶，即其中一种荧光素酶作为报告基因，另一种则作为内参，可以减少外界因素对于实验数据产生的影响

大致过程：

1、构建一个将靶