实验一-淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定-副本-(2)13087

实验一--淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定---副本-(2)

本科学生实验报告

学号124120463姓名：

学院：生命科学学院专业、班级12级生物技术

实验课程名称：酶工程实验一

教师：吴倩

云南师范大学教务处编印

0.00.22.03150.20.41.83150.40.61.63150.60.81.43150.81.01.23151.01.21.03151.20.83

葡萄糖标准溶液0.00.22.03150.20.41.83150.40.61.63150.60.81.43150.81.01.23151.01.21.03151.20.83体积（ml）葡萄糖含量（mg）0.0

缓冲液（ml）

DNS(ml)定容总体积(ml)15

OD（540nm）②待测酶液的制备：a.将发酵液倒入离心管中离心，离心条件4000转/5分钟，将离心后的上清液倾入试管中，稀释一定倍数测定其酶活力b.底物溶液—2%淀粉溶液（需当天配置）称取2.0克可溶性淀粉，用约80mL缓冲液调匀，加热煮沸直到淀粉完全溶解；冷却，并用缓冲液定容至100mL。注：如果测定所得OD值不在有效值（0.2-0.8）范围内，则相应地降低或增大稀释倍数后再进行测定。③淀粉酶酶活测定方法操作步空白管样品管A样品管B骤步骤1吸取1.8mL可溶性底物溶液吸取1.8mL可溶性底吸取1.8mL可溶性物溶液底物溶液步骤237℃保温5分钟37℃保温5分钟37℃保温5分钟步骤3加入待测酶液0.2毫加入待测酶液0.2升毫升步骤437℃精确15min37℃精确15min37℃精确15min步骤5加入3mLDNS试剂终止反应加入3mLDNS试剂终止加入3mLDNS试剂终反应止反应步骤6混合均匀混合均匀混合均匀步骤7加入0.2毫升待测酶液，沸沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min水浴煮沸5min步骤8流水冷却流水冷却流水冷却步骤9加蒸馏水10mL，混匀加蒸馏水10mL，混匀加蒸馏水10mL，混匀步骤10OD540nm比色OD540nm比色OD540nm比色

五、酶活测定注意事项注：

1.试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止或沸水加热时脱落；

菌落形态

0.8cm

0.9cm

0.5cm030.60.4911.21

量0.240.80.718y=0.9479x+0.126R=0.9998系列1含0.45菌落形态

0.8cm

0.9cm

0.5cm030.60.4911.21

量0.240.80.718y=0.9479x+0.126R=0.9998系列1含0.451.00.9220.6糖0.661.21.133线性(系列1)0.4萄0.80.2葡011.2不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头！3.精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；4.避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；5.实验结果的记录与分析六、实验报告

（一）淀粉酶产生菌的分离结果筛选结产淀粉酶菌落透明圈稀释数大小倍数菌落疏松，呈绒毛状、絮1.1cm,1.0cm10-36状、蜘蛛网状，大多为白色，0.9cm,0.8cm有的为淡黄色和黑色0.5cm,3cm10-41绒毛状，圆形，白色

10-51絮状，白色

10-61絮状，淡黄色

10-7

（二）葡萄糖标准曲线绘制①葡萄糖标准曲线的制作编号12葡萄糖含量0.20.4OD（540nm）0.0840.285

葡萄糖标准曲线

）1.4lmg/（m0.8

0OD

②糖化酶活力测定结果

样品管A0.332样品管B样品管A0.332样品管B0.289

OD（540nm）

③糖化酶活力的计算OD的平均值=（A+B）/2=(0.332+0.289)/2=0.3105根据酶活计算公式：酶活（U/g）=（(A×K+b)×N×1000/（T×W））×5A:样品的OD值(平均值)K:标准曲线的斜率N:稀释倍数5:0.2毫升反应液转换为1毫升体积T:反应时间（min）1000:转换因子1mmol=1000μmolW:葡萄糖的分子量（180.2g/mol）代入数据可得：酶活（U/g）=（(A×K+b)×N×1000/（T×W））×5=((0.3105×0.9479+0.126）×1×1000/(15×180.2))×5=0.77753、思考题：请你建立一个“筛子”，从土壤中筛选出能产生植酸酶的微生物。答：采集土样(除土层表面枯枝、杂草和砂石，收集距表层5cm~10cm土壤)将采集的土样进行10-1~10-6梯度稀释后，分别涂布于改良的含溴甲酚绿的植酸钙平板初筛培养基上，在30℃的恒温箱中培养3d，然后观察菌落周