蛋白质的方法

蛋白质的研究方法

生物化学教研室2010-101主要内容蛋白质对象的选择和样品的获取蛋白质的检测和鉴定蛋白质的结构分析蛋白质生物功能检测

2蛋白质对象的选择和样品的获取3

一、研究对象的选择无论何种来源的生物材料一般都含有成千上万种不同的蛋白质分子；在一种生物组织中，同时又存在着多种蛋白质组分。虽然它们都具有肽链结构，但在分子大小、极性以及电荷上会有所差异。

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选择研究蛋白的原则：在组织中含量比较高相对比较稳定的蛋白质（如血液中的Hb；肌肉中的肌球蛋白和肌动蛋白等）从模式生物基因组测序结果来看，每一种生物有机体内都还有大量的蛋白质（50％左右）从来没有被研究过。5获取蛋白样品的方法：

直接从生物组织中提纯蛋白—为主根据基因组测序获得的信息

6应用各种分辨效果好的化学及物理化学方法7直接从生物组织中提纯蛋白——蛋白质的分离纯化包括以下过程：1.破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来；2.将有关的蛋白质分级沉淀下来;

（盐析法或有机溶剂法）3.应用层析法或电泳法使它们各自分开；4.蛋白质结晶；5.蛋白质纯度鉴定和含量测定。8根据基因组测序获得的信息

（1）可以获得所要研究的特定蛋白质的AA序列。

先根据推出的AA序列合成对象蛋白中的一段肽，用它去获得有关的抗体，然后用抗体去探测蛋白质的存在，甚至可以用抗体通过亲和层析纯化对象蛋白9（2）去亲获得过有关基因裹的cD披NA全序享列，然彼后通持过重嫁组DN烦A技术渣去表兄达重肠组蛋涌白。有偏抖差，斥甚至水完全席是假敢象。即使奔推测售得到白的蛋古白质啊编码管信息忽是对博的，弯在细气胞内垫还存摄在转壮录后梯的RN燃A加工知，翻但译后妹的蛋枯白质颂的修由饰和雄加工感等基屑因序豆列上俭目前码还无奶法反止映的挂信息尸。10制备亩过程规中注蓬意事旨项：要求新自始拆至终离保持辽在天然纲状态避免设一切氏过激刺因素--如过闻酸或残过碱拘，高念温，重金玩属等遭的影景响。2.通常蒸都在滚低温廉条件库下操码作。3.尽可州能使链样品际中蛋约白质业的浓宜度维贷持在用较高水平璃。11二、羊细胞色的破奴碎少数蚀蛋白凑质--诊-存在店于细址胞外欣面（偶如血惊液和泊体液亡中）大多钩数蛋借白质--坦-都存礼在于偶细胞械的里糕面。一般衡固形局生物抽材料霞首先深都必恭须加设以破败碎，慨以释削放出规细胞协内的割蛋白错质组繁分。生物劣材料也必倦须新险鲜要求皂：1.材料-8洒0℃2.或者材制成灾干粉箭（丙株酮）3.低温抚存放12破碎后的方怪法：机械隶破碎械法：利用追机械侄力的鉴搅切催作用最，使卧细胞躲研碎高速拌搅切农器、甚玻璃才匀浆超器、蛮家用稳搅肉何器、闻研钵供、平玻萝璃珠盯高速荐匀浆测器以煤及静设压器抗（高阴压破谅碎）。2.渗透脊破碎泳法：利用枕低渗傍条件夸，使堵细胞帖溶胀厘破碎放。红血示球放盆于水伟中，税便发哪生自僻溶。13*抽提远作用：生物僵材料李在破橡碎的探过程弱中，较通常删被浸适在适当牧的缓禾冲液夺中，闯使细置胞中访的蛋虑白质炼等内姻容物释李放到复这种喷溶液浙中去萄。143.交替勉冻融图法：生物艇组织揉经冻泳结后钢，细壤胞内虾液结脸冰膨社胀而使好细胞甲胀破你。4.超声禾波法：利用香超声障波震寨荡，局使细威胞膜陆上所将受张凯力不埋均而悼解体牢。5.酶消石化法：利用光蛋白险酶、学溶菌气酶、管蜗牛秘复合溪酶等臂对细胞侧膜或患细胞属壁的炼分解揭作用哲，使叶它们挤解体15三、姻去污慎剂处认理溶砌解膜做蛋白膜蛋厨白的哈提取挣与细属胞质坏蛋白夜，核柱蛋白蹄提取搭不同碍之处驼在于偿它是锤嵌在诉膜中境的，筑水溶树性不层好，屈基本百方法御就是面用不售同的誉离心幅速度籍去掉与胞质葵蛋白箭等，缎最后袭用去基污剂叔把蛋和白从烫膜中脑释放尼出来队。膜谣蛋白世分离伶纯化骗的重槽要步鼓骤是破选择矿适当密的增港溶用借表面释活性下剂16膜蛋巾白的蓬处理破：复努杂细胞普膜的井结构17按其缴所在位置大体捧可分摄为：两种贡类型似外狱周蛋洲白（通过欧次级救键和赤外膜变脂质发的极性闭头螯毕合在崭一起积）固有缩慧蛋白外周榴蛋白--健-选择很适当纯离子镜强度诸及PH的含扬有ED侨TA的缓冲棚液抽谨提（窗高盐聪溶液脉）固有惊蛋白--和-嵌合驱在膜奔双层林中，体它通腊过疏水赤作用与膜内缴部脂疑质层的疏银水性羽尾部书相结粮合，具有α螺旋蝴结构。18去污富剂：一类冬具有亲水怕性头派部疏性编尾巴的双拒亲性嚼（am杰ph粥ip汤at糕hi降c）脂子类分晓子作用忽：既可柄以破焰坏细葱胞的磷脂民双层涝结构，又梳可以芳与具后有疏案水性骨表面凯的膜蛋份白结哲合，从升而阻锐止释愤放出士来的碎膜蛋挂白通施过疏铺水相杜互作劳用形课成大幼的、升可沉奔淀的注聚集伏体。19有的去污遵剂的趴亲水月性头掩部可焦离子它化（即矛含有匀一带区电基稳团）如：脱氧炮胆酸党钠（so梅di腥umde爸ox巧yc证ho怨la喷te）十二症烷基朝硫酸米钠（so睛di代umdo勒de沿cy办ls惰ul筐fa陈te，SD鸟S）有的去污剂饱不能忍解离欲，所窜以分段子中蛾缺少伍带电服基团，纱如蕉：Tr伸it姥on萝X毙-1肉00，辛基广葡萄具糖苷(oc伏ty鸦lg静lu慨co尸si对de）20临界傻微团呜浓度（cr映it扛ic觉al撒m哭ic从el呢le阴c泛on列ce羽nt帅ra戏ti切on，CM语C)：每一抬种去弦污剂堆都具智有一师特征复性的CM钉C。CM逮C值与拾其分锁子中疏水奖部分与亲水曾部分的结构有裤关稍。当[去污愈剂]低于聪此值适的时群候，因去污乎剂分小子在哄水溶冰液中胜将不接形成摩微团骗，达素到此覆值的悟时候脏，微母团开半始形严成。21离子越化去造污剂朽（SD届S）：其“疏水已尾巴”破厕坏蛋柴白质酷分子斗的疏些水性糕部分行的结部构，拼其带胡电的乔“头部”破合坏蛋钓白质像分子嫂中的眨氢键损和离堡子键院。作用枝的结患果是：使任歼何蛋蜂白（鞭不管类是膜毅蛋白爽还是差水溶饶性蛋欣白）露都发生禾完全肌变性，并溶解你在水溶液皂中，康同时失去伴生物疾活性。在部桌分情社况下姑，当惑去污次剂被四透析哑掉后禽，蛋帮白质植可以拌复性桂并恢嫁复生塑物活渐性。22SD铃S-聚丙衔烯酰季胺凝敢胶电暗泳（SD郑S-po听ly稳ac请ry鸟la允mi石dege拣l绪el倚ec饿tr障op故ho苍re自si脂s，SD籍S-鸭PA蒸GE）：就是馆利用SD鬼S的这后种结车合在命整个利蛋白哀分子牧上，顿并使斗蛋白很完全弃变性枝的特拘性。这样煎经过SD孩S变性妻的蛋纠白质炸在电届场中匆完全按大吉小分离避开。23非离敞子去博污剂：相对友温和狮，一努般不会田使蛋家白质悟变性。只默是将悠蛋白涌质分镜子从鼻膜上类溶解毙下来摘而已敏。当[去污充剂]＜其CM载C值的鹿时候谷，去舟污剂居分子你与膜绍蛋白愤表面谱的疏甘水区锅域结由合，佣使蛋泊白质阿在水忧溶液午中溶利解而援不聚抽集。当[去污耐剂]≧其CM饥C值的棋时候界，去透污剂冠分子茶将与合膜磷酷脂一蒸起形散成混禁合微锈团，密膜蛋哭白以疑整合划在微宝团中茄的形最式存财在。一般乡丰选择黎非离券子去跨污剂来保持暂膜蛋秤白生狡物活新性242526四、熟蛋白暂分子温的稳价定防止职蛋白岛质分该子可讲能被障同时垒释放赔的蛋劳白质疼水解蚀酶降茂解、Pr空间瞎结构唇可能浆被温骨度或拼化学袄试剂队等环求境因屯素破疑坏而编丧失陆生物绒学活融性等度。处理：需吸要在抹缓冲但液中石加入究蛋白奶酶抑汽制剂港；在低均温下垄操作羊；加入届稳定掘剂(如甘涝油等言）．27五、丢细胞盈碎片纵的去课除——离心(饮ce疫nt往ri辜fu驱ga柿ti粪on店)原理证：悬框浮在暑溶液摄中的望两个水或多帆个不木同质受量或旧密度浴的颗缘瑞粒（党如细仙胞、唤细胞耍器、同大分允子复荡合体聪、或幻玉分子保等）晒沉降床到试耗管的泛底部恰的速辛度是枝不一烟样的商，质量越暗大、歉或密梯度越侍高沉学降的应速度暴越快判。沉淀踏：固钟体性附的细室胞碎贡片和驳细胞尸器沉处降到听离心出管的底部梨形成痰；上清食：绝姥大多浴数蛋沉白分网子或难蛋白吓复合订体保爸留在供细胞抽提种液中团即上忆清中脖．28六、来目标观蛋白萄质的牺分离签、纯侮化--蒜--岩-蛋白调质的揭分级羞沉淀族和层馅析分懒离将不弯同蛋屠白质庙分开驻的性友质主轨要包远括：分子散量的赠大小带电呜情况水溶寨性与某柏种物巡寿质的堡特异俘高亲匠和力句等29（一惹）蛋纽奉白质价的分光级沉必淀常用浙的方宗法有仆：盐析早法有机哭溶剂故法30蛋白坛质的值胶体休性质然：蛋白构质颗驱粒表累面多殊为亲冠水基京团，圾可吸干引水锯分子抵，使炉颗粒院表面舞成有园一层注水膜，蛋纵白质挥颗粒杨相互流隔开竭，不搜会聚简集成双大颗戒粒而仍沉淀擦。此外局，蛋鸽白质供表面包可带站有电警荷，文可起厘胶粒威稳定彩的作用折。若去戴除蛋怠白质城胶体成表面屋电荷枣和水超化膜沿两个卡稳定轿因素养，端蛋白皮质极侦易从泰溶液撞中析胀出盐析泥法31#32盐析菌法概念：将中性稀盐加津入蛋我白质辱溶液魂，破姥坏水断化膜拐和电置荷而纲使蛋骗白质金沉淀途，叫这盐析烘。各棚种蛋写白质夸盐析腿所需翅的盐澡浓度垫及PH不同取，加刮入不扩同浓男度的愧中性棕盐可使各对种蛋坛白质码依次宣分别蚊沉淀管出来青。优点色：操剃作简挂便对易画变性奥的蛋盘白质呼有一太定的喉保护做作用被，适用桨范围警十分呆广泛久。缺点搁：分班辨能权力差护，纯壶化倍尤数低331.基本膝原理在蛋捏白质敏水溶矛液中糕添加弄无机念盐，哨可以般产生泄两种影响彻：(1菜)盐离冠子与Pr分子中的敲极性耐基团离子店基团蛋作私用降低Pr分子漂的活同度系脸数，碎趋使要其溶雹解度另。(2剩)盐离矩子也与水这种戴偶极飞分子盖作用犹，使贫水分韵子的笛活度降训低，乏导致Pr水合宫程度写的减胜少，投从而朝趋使Pr溶解度俩。34*盐溶锐（sa洪lt涂in桂g哥in嘱)--当溶相液中且的盐质离子扩强度间比较凝低的期时候破，蛋闯白质她的溶萝解度毯会随蹄着盐驱浓度既的增废加而泄增加样，这轿种现线象叫赢做～.*盐析杏（sa透lt挽in软g落ou夺t桨)-科-但当乏溶液蚁中的遮盐离态子强门度比危较高煎的时庆候，避蛋白嫂质的虫溶解用度会若随着伏盐浓茶度的辽增加未而降州低，悠这种粪现象忌叫做～.一定菠的盐罚浓度费下，伸每一烤种蛋组白都道有一嫂不同尼的特殊异溶裤解度波。35影响飘盐析欢作用洒的因鹅素（1）盐枯的种塘类（2）PH和温武度#（3）蛋钱白质志浓度%36（1）盐镰的种季类对同臣一种Pr而言吩，价数死愈高的盐碧离子离，盐付析能远力也愈丧强:PO3-4＞SO42-＞C2O42-＞（CH饲OH售CO垫O-）2＞AC－＞CL－＞NO3-＞Br-＞I-＞CN论S-K+＞Rb+＞Na+＞Cs+＞Li+＞NH4+负离搭子价鲁数较摩高的日中性能盐（如蜡硫酸斑盐、冒磷酸免盐等两）的Ks值常捷较一恨价中盯性盐寒的Ks值高免。Ks近:盐析弯常数克（价分数较美高时堆，Ks值也洽较大邮）。亦代表夜盐析瞎的效征率，麻是与Pr及盐术种类闭有关倾的特德性常鄙数。37硫酸透铵（常揉用盐隐析剂超）优点济：盐滔析能拣力较毛强具有慎较高浴的溶帆解度较低鞋的溶反解度求温度蚂系数价格笛低廉不产秤生副堂作用踪蝶。缺点脖：缓夺冲能讯力较凡差PH难控生制38（2）PH和温航度S。代个表蛋席白质适在无冬机盐拦溶液伍中的蓝溶解尺度除取员决于Pr的种率类，仆还受PH及温堂度影希响:PH似=P处I时，S。的数课值极穗小S。随温破度增简加而哪减低五。盐析质过程畏中，彼若增慎高温胃度，钞有助艳于Pr的析祸出。#39（3）蛋续白质臣浓度[P寨r]较高，在唱较低镰无机界盐浓寄度时,蛋白柏质便岔开始析坛出，垄盐析直界限齿比较邀宽。[P娘r]较低，需挣要无爆机盐茄的浓栗度也肌高，舰即盐巩析界限钩变窄磁。40蛋白裙质浓谁度愈警高，剂所需勺盐的蛾饱和颜度极堂限愈奴低。但蛋铸白质滚浓度嗓愈高肚时，孝其他轻蛋白命质的链共沉剧淀作体用也愈倾强所以戏当蛋顽白质乒溶液夏太浓淹时，事应适庸当稀设释，通常触在2.巴5～3.银0％之间京比较毅合适惩。411.基本嚷原理（1）在PI附近卡，Pr主要抬以中侨性离栋子形阴式存疲在。坊此时阳若添靠加有机队溶剂贷，由颗于有机考溶剂可使丸溶液电离常数减小船，增岛强了中性象离子躬间静群电引译力，船从而艇使分鸦集合掉而沉窝淀出助来。（2）有机增溶剂本身委的水垮合作脚用会讨破坏Pr表面针的水缎合层怖，也促使Pr变得老不稳脖定而蜡聚集碎析出.常用忧的有胖机溶程剂：形乙醇宁和丙意酮有机秀溶剂吓法分辨错力比限盐析胁方法岗高，浅提纯导效果知好422.影响迷有机导溶剂茫沉淀Pr的因平素（1）PH值PH航=P醉I时携蛋白摩质的制溶解貌度最屿低。蒜按PI来调汉节PH值，有利槐于分香离。（2）蛋慢白质译浓度[P柳r]越高者，加今入一释定量族有机骨溶剂墙后，Pr析出掉越多缩慧。此时禁溶液迷的介电隔常数也相顿应提烂高，甩可以蜡减少Pr的变核性。[P羡r]越高,P陪r分子承间作机用引斯起的怪共沉春淀现弯象也柳显著增强凯，这瞒样分挡离效撤果差辈，不涂利于瓜分级秒沉淀右。只有树选择镰恰当蚕的[P胡r]才有兆可能横获得刮良好买的分勺高效哪果。43（3）离免子强袜度中性液盐的储加入损能促塌使Pr在有伞机溶平剂中河溶解汗，并且似能防狭止Pr的变批性。表但含煮盐过振多，层却会裤使Pr过度脂析出拆，不档利于哀分级挨沉淀围。一般鬼∠0.城05展M的稀腰盐溶估液。（4）多绣价阳抚离子Pr与多科价的晶阳离兄子如砌（Zn2+、Cu2+等）亦能结合成至复合马物。康这种越复合驳物在挪有机卫溶剂剧中往旁往使Pr溶解膝度变摘小。44常温循下有胁机溶斑剂可索使蛋述白质铃变性砍，低温滤条件下可萌减慢藏变性队速度宝。因卧此用葬有机土溶剂蓄沉淀瓜蛋白磨质时棒应在皮低温值条件堵下进汁行。如利番用丙件酮沉妇淀蛋订白质割时，错必须芽在0～4℃低温肆下进义行，盆丙酮当用量-般10倍于枪蛋白独质溶多液体牌积。百蛋白昨质被跳丙酮墙沉淀易后，齿应立赶即分稻离，露否则魔蛋白伙质会贷变性跌。缺点东：易使诱酶和变具有旨活性肌的蛋低白质影变性郊。故之操作晚时要唉求条吉件比宿盐析稍严格胖。对敢于某士些敏筝感的薯酶和兴蛋白散质，毛使用卷有机店溶剂近沉淀醋尤其托要小归心。45(二）蛋白登质的号层析证分离姐法（色昼谱法眠）最基办本的膊特征之：固定纤相流动哈相46原理—各种抓物质枯得以忽分离如的最扬基本贸原因瓦：就脑在于延它们匠在这两个希相之间具再有不摇同的洋分配呜系数.两相只作相业对运毕动时块，这些览物质免在两紧相间难进行厕多次姓的分铜配，勇即使说它们嚷的分配系阶数只词有微早小的敬差异剃，通居过这爬个过凳程也酷能得盖到最大的笨分离高效果止。47层析债分离糊能力调的实颤质—物质务的分户配问皱题*分斗配系院数：当一侨种溶顽质分养布在赔两个乒互不衫相溶茄的溶木剂中济时，近它在玩固定汪相和稀移动莫相两维相内下的浓度婆之比是一求个常续数，枪这称腥为分恢配系呢数。C1K隐=稻C2*质量旋分配鞭系数绩：若不型用浓街度而允用物质批的绝油对量塞的比爽值来表栋示，前则称绑为质片量分遥配系赏数即态：VsD=林KVmVs:固定群相的剑体积Vm:流动亭相的阴体积48种类节：气相洒层析按两相针状态来分宗液相枪层析吸附贪层析分配主层析按层析迹机理来分歪离子血交换努层析凝胶着排阻代层析亲和且层析柱层山析按操作换方式来分竹薄层峡层析纸层值析层析娱法分厌离、锤纯化：Pr、多肽尝和AA49离子锡交换赞层析争法*原理蝇：阴（阳痰）离睬子交尝换树骡脂颗吃粒（菌作为污固定痰相）填充害在层年析柱燥内，根由于阴（阳捞）离霞子交聋换树脂颗葱粒上钟带正（负爆）电热荷，脉能吸恰引溶易液中聚的阴（阳耐）离侧子。尼然后派再用显含阴生（阳假）离哀子的溶液搜洗柱栋。含灵负电些量小昌的蛋什白质丢首先裂被洗诸脱下来俩，增胆加阴功离子缸浓度梁，含遥负电恨量多盛的蛋胶白质也孙被洗圆脱下价来，已于是身两种州蛋白家质被烫分开判。5051固定像相：1.纤维搂素--柳-DE牢AE纤维销素、CM纤维悼素2.葡聚嫂糖52纤维棍素:骨架豆为柔慨性长校链1.加入伞量穴：加入量层析本柱的渴蛋白丘质量曾通常册纤维不素量扮的十分膏之一树。2.提高备分辨葱率，杯样品竭体积射应尽手可能撇地少亲。3.在洗下脱时朗，可缺以通方过改变辱洗脱时缓冲讽液的PH，而使嗽蛋白伟质分柴子电源荷减蛛少而修被解贫吸下埋来，腔也可以贤通过提高恒洗脱基缓冲拦液中混离子胸强度，减壮弱蛋白氧质分切子与载载体扶亲和霜力的撒办法狂，将闪蛋白妄质组分叨逐一源洗脱廊下来乡丰。53葡聚粉糖的物离子蒸交换蛮树脂:骨架耐为三翻维网途状结烦构优点：1.同时守具有嚼分子糠筛的灭作用2.因其贿高度胀的网饭状结戚构，茫所带能有的父交换容基团聋也比妇纤维素多屯得多弱。交队换容舟量为厘离子备交换唉纤维跑素的3～5倍。缺点功：它的换床体陈积常撤受PH或盐兽浓度柔影响乌而变顶化，采对分幕离效果促有一第定程椅度的巡寿干扰樱。54凝胶研（排跳阻）围层析又称分子绞筛或线凝胶捉过滤（ge辱l袖fi倚lt匹ra哥ti鼻on）原理恼：载体淋为有骨一定坐孔径餐的多裙孔性狱亲水恋性凝填胶。当分锄子大隆小不兔同的售混合悲物通敌过这庆种凝天胶柱详时，直径虎大于江孔径湿的分省子将岩不能夫进入件凝胶手内部惯，便直村接沿阔胶粒盾间隙轮流出宾（全雪排出敬）。鲁较小滑的分子别进入洁能容苦纳它笋的孔贴穴，伪绕道来而行箩，在远柱内保汉留时属间就娘比较洽长。恰这样缸，较翠大的炮分子识被先洗脱哨下来粥，而古较小泡的分括子后匪被洗稻脱下夺来，田从而达到味相互斧分离番的目隐的.#55用作伸凝胶裁的载预体物改质有祥三类：交联多葡聚续糖凝嘉胶商品粱名为Se择ph游ad确exG聚丙滋烯酰械胺凝园胶商品纱名为Bi辅o-苍ge裙l延P(丙烯滴酰胺+蚀N，N’超-次甲播基二姥丙烯巷酰胺江聚合古而成P值表赛示不约同的托交联例度)琼脂谢糖凝峰胶商品井名为Se山ph这ar积os齿e或Bi脊o-识ge看l袜A（从海掩藻琼末脂中砍分离岭除去唯琼脂发胶后谊的中峰性级殿成分是D-半乳耳糖和3,介6-脱水-L夺-半乳盛糖相窝间重牺复结合而妹成的帜链状莲化合漫物）5657琼脂咐糖凝朋胶优远点：1.其机覆械强胃度比喉葡聚摧糖凝众胶和效聚丙您烯酰基胺凝胶好失得多低。2.对蛋互白质膜等高廉分子植的吸亭附作住用也轿小得厉多3.适用垄分子宅量的滥范围老宽，勒最大牙可以绒到108。58凝胶饶排阻反层析断的应则用：1.作为高分析面工具(分子劲量差沙别大世的物搬质)2.作为惧脱盐恰工具(Se如ph雕ad府exG-借25诉)3.高分括子溶环液的漫浓缩(不稳自定的软高分恶子)4.去除讽热原捐物质(D绣EA盖E-胳A-消25奥)5.物质访的分牢离提哗纯6.用于利测定剃高分真子物烦质的吐分子火量59吸附抓层析着法原理俗：柱层由析中朵，含怠有Pr分子首的混遇合物欠随流遇动相奥通过由吸附竿剂组成惠的固往定相它时，Pr分子冲通过休各种次腰级作崭用能鹿够吸唉附在孙吸附船剂上,由于股不同历分子的纪吸附杯能力逗不同途，可李以通储过洗胜脱使睁它们桐逐一解突脱出情来，爷而使拥混合施物得盾以分团离。优点伤：1.物理短吸附焦，吸井附能雅量比蛋较低须，洗汁脱也淋比较搅容易耻。2.操作禾简便葛，吸构附剂示容易旋获得流，价唤格较瓜低廉60固定土相：吸附谱剂—磷酸田钙凝坚胶磷酸突钙胶Ca3（PO4）2磷酸笛氢钙俱胶Ca巨HP童O4·2纱H2O羟基酒磷酸油钙胶Ca5（PO4）3OH差[羟基辅磷灰渠石]磷酸焰钙胶构对蛋滴白质严的吸布附作尸用原信理:主要成是由昌于酱１.躬Ca2+与Pr负电裳荷性故基团结合胀。２.磷酸陈基团极与Pr正电驰荷基披团61流动雹相：洗脱袍剂--柠檬辫酸盐作用庄：柠酿檬酸势离子美因与Ca2+有更插强的派相互招作用烟，它能准大大降低蛋白鹊质和通凝胶臣的吸蜘附能姻力。Na纸Cl，KC拆I甚至按浓度抗高达3M时，押也不堡影响Pr负电帮荷的吸邪附，锣相反戒这些莲盐可皮以大辫大降匹低Pr正电亭荷的吸雀附。械因此孤在高充浓度竭的这泼些盐醉溶液追中应姓用羟牢基磷汽灰石结进行杰层析蚁时，旨可以岸专门匀吸附梳酸性军蛋白绣质及腾中性匹蛋白腊质而饮排除蔬碱性贼蛋白稿质。62亲和解层析蹲法1.原理：利爹用生遭物高钩分子驼具有客能和葛某些客相对篇应的杏专一分子封可逆链结合蜻的特爱性。如，酶的锈活性看部位药能和铜底物\抑制思剂\辅助碧因子设专一性灭地结交合,改变趋条件省又能扯使这坟种结卫合解瓦除.[酶的途变构顷中心识与变纹构因胀子（所或称女效应辱物）踏之间、网抗体炉与抗焦原之雪间、扰激素庆与受使体之凶间，液结合蛋议白与桑结合唉物之棵间]。这些辛被作革用的信对象唤物质望称之躬为配基柱（li坑ga壮nd)。63固定唐相--配基固定秋在固相困载体上64652.优点：具期有高所度的疏吸附雷专一驻性层析马过程柿简便火、快当速3.载体聪的选除择：(1缓)必须被具有拿高度幸亲水桥性，桃使Pr分子虚容易泊与它雹接近.(2报)非专摇一性毕吸附脂要十年分小那。(3科)必须壳具有絮大量南可供还活化岔而能比与配踪蝶基结尚合的陷基团疯。常用元载体：纤维痕素、齐葡雕聚糖骄凝胶暖、琼息脂糖父凝胶旦、聚丙尖烯酸栋胺凝周胶和滑多孔色玻璃等。66高效掏液相模层析嫩法（Hi封gh淡P样er饼fo降rm斩an驱ce士L张iq移ui辟d海Ch孙ro槽ma盆to肾gr滋ap踪蝶hy，HP盒LC）又称强“高压叙液相知色谱，是色谱庭法的一越个重片要分断支，侄以液体为流动揉相，采坡用高池压输途液系灭统，竟将具披有不尤同极性的单何一溶剂或不众同比拿例的待混合桌溶剂宾、缓呜冲液环等流考动相得泵入网装有狮固定部相的色谱虫柱，在拌柱内籍各成驳分被测分离队后，绝进入爹检测礼器进崇行检丹测，层从而辜实现疮对试鸦样的具分析稀。67HP夜LC包括欠：输液州系统径：驱动裙流动镜相和曾样品醒通过活色谱盛分离妹柱和霸检测里系统层析位柱：分离刊样品榴中的岗各个盈物质进样贿器：将待企分析刊样品浙引入私色谱末系统检测域系统睡：将被灰分析差组在翁柱流移出液谈中浓忠度的邀变化起转化笛为光敢学或首电学恼信号，并区分析像显示尤出来686970分啊类(1延)液一族固吸段附层灭析(2误)液一徒液分腹配层宪析：是应鞭用最失多的叉方法手之一皇。(3闯)离子荷交换敲层析(4命)凝胶私渗透趴层析71⑴液-固吸堪附层纸析：落固定它相是忆具有疾吸附夺活性笔的吸还附剂挠，常手用的返有硅拨胶、榜氧化固铝、价高分敏子有席机酸忧或聚它酰胺汽凝胶虾等。缓液-固吸咸附层虫析中铁的流秃动相叼依其颠所起蹈的作肉用不罗同，挣分为确“底辛剂”赢和洗形脱剂界两类任，底友剂起茂决定凉基本益色谱浆的分跨离作为用，森洗脱凶剂起钻调节痕试样景组份环的滞阔留时抹间长壮短，真并对效试样菌中某恨几个蕉组份尚具有歇选择适性作浙用。72⑵液-液分拐配层冲析：德固定准相为然单体鸽固定添液构迈成。蜻将固婶定液饥的官辣能团贩结合油在薄缸壳或史多孔测型硅认胶上粮，经活酸洗代、中污和、群干燥屋活化践、使仍表面链保持屯一定评的硅巧羟基跨。这万种以寨化学饮键合确相为岛固定仰相的盆液-液层狗析称消为化涉学键流合相丈层析淘。另冤一种惑利用氧离子巾对原督理的君液-液分匙配层雨析为型离子箭对层拒析。73⑶离跑子交防换层郊析：躁原理选与普弊通离治子交盾换相袋同。悠在离俘子交芳换HP中LC中，泽固定叙相多呈用离委子性剩键合秩相，蝇故本礼法又腾称离雨子性封键合杜相层悔析。饶流动润相主刘要是左水溶筝液，pH值最满好在烛被分往离酸两、碱情的pK值附输近。74蛋白愚质的闭检测堵和鉴奴定75一般丸可通填过以草下几添个方贪面进音行：光谱婶学特生性电泳虚行为特异蚊抗体辱反应特异彼生物吊学活罗性N一末糠端氨蓄基酸秧序列榜测定质谱咳检测排阻取层析76一、烘光谱贤学特沙性光谱宜特性动的总凡原则珍是：当一爸定波贱长的赴光（匙即电帆磁波像）与Pr分子灾接触林时，许所吸华收的摸或反烂射的卸辐射简能量堤与Pr分子劝结构怀特征帅和浓乘度是讲密切盟相关访的。77不同放波长暴范围吴的电构磁波呜与其床作用货后的研剩余阀能量诸值反唉映的框是蛋怀白质疗分子搞的不耽同特口征:19扑0括--局20碎0n熄m波长惭范围洒的光碎吸收肾反映盒的是蛋白输质主过链上怕的酞甩胺键阶中电皮子的眨被激余发；23眉0桨-温30仅0n漂m波长库范围返的光节吸收浩谱（蓄最大俘吸收启值在28粉0n蚂m波长缝处）炎反映漠的是蛋白架质分何子中猎芳香况族氨蚁基酸是侧链己上电哥子的迈被激课发。所以凤一般宜情况读下，柜溶液紧在28吸0n帽m波长佣处（滔属紫骡外光范蚀围）罩的光班吸收辛能力诉被当街做是存在蛋白布质的门证据歼。78二、维电泳支检测蛋白阴质分然子为晶两性稍电解共质，钩在不嚷同PH的溶软液中遮带有及不同稿的电殿荷，查从而叫在直铅流电尤场中静能够鼠泳动材，这他就是电泳肾现象。按介质蛙状态来分:自由按电泳区带夜电泳按操作笔原理可分叫为:一般蹈电泳等电咱电泳等电饼聚焦栏电泳免疫走电泳收等79自由秤电泳--以溶液为介贝质，浇在溶睡液中爬将蛋蚂白质串分离缺点:自由绵电泳循过程狮中扩黄散严钟重，恒分辨贿率有姿限区带艘电泳--在固牧体支纳持物覆上所论进行仿的电范泳．固体蓬支持施物有:滤纸虫、醋酸厕纤维兆薄膜列、琼脂欺糖凝致胶聚丙仿烯酰录胺凝拳胶优点:分辨轨率很畏高。80SD狂S-聚丙掉烯酰绪胺凝职胶电芳泳SD格S–蔬(十二净烷基雁硫酸弟钠)是阴牙离子塌型去尝污剂(S怨od吩iu赞mdo程de趋cy稠lsu墓lf校at恼e,迅S报DS炸)Qu票=（迁膝移率涂）6π毁rηu与Q、r有关若蛋众白质散分子吵带有节足够坦的电迈荷，剑在SD卵S-政PA滨GE中进行电筋泳，陕由于李分子熄筛效葡应，u仅取丙决于杂分子话的大小小。因此SD敞S一凝庄胶电抗泳可挑以按蛋白下质分耀子大想小的窝不同将其分开划。这时倦，若狗以分众子量俗的对槽数（lo芹gM）对相船对于妹染料观前沿的迁激移率厅（Rf）作图邀，呈倘现线膜性关稳系。8182这种岩关系糟，对匠一种无胶浓请度时窄，只材适用蓝于一凝定的分子酒量范浴围：5％胶逃浓度版时，管适用话于分章子量6～20恩0万的区拐间；10％胶昏浓度吸时，匠适用使于分你子量1.专6～7万的午区间悉；15％胶床浓度智时，乳适用纠于分宁子量1.耽2～4.信5万的某区间浴。83聚丙拦烯酰厨胺凝谊胶电蔽泳图殿谱84等电里聚焦钥电泳——（is拉oe搅le龄ct偿ri齐cfo驻cu奏si胞ng辰,偶IE利F）是一利种根尚据样肿品的灯等电崖点不萌同而袋使它厕们在pH梯度中相低互分和离的晴一种露电泳蕉技术玻。利用验特殊盼的一队种缓客冲液令（两越性电铲解质应）在滥凝胶钉（常宜用聚宗丙烯卡酰胺丙凝胶迹）内孙制造幸一个pH梯度书。pH梯度胞制作持利用扶的两辜性电景解质娃（am咏ph谁ol底yt厨e，商转品名界为am调ph领ol吩in把e），乔是脂财肪族退多胺改和多死羧类谷的同月系物硬，他办们具杜有相赌近但击不同佩的pK焰a和pI值。翼在外血电场熄作用蓄下，朝自然厦形成pH梯度匪。或凝胶趴可用局：聚博丙烯芽酰胺鱼凝胶各、琼甩脂糖释凝胶塔、葡久聚糖驰凝胶畜等85Pr分子牲有一吐定的PI，它侵处在客一个浑由阳极误到阴仆极梯度沃逐渐巩增加泊的介瞧质中牲，并敞通过铅以直承流电泡时，脏它便补“聚瞎焦”初在与其PI相同言的pH位置梁上。PI不同尘的蛋照白质骆泳动馅后形剂成位征置不羽同的刚区带隆而得险到分色离。86优点丈：1.有很缸高的屋分辨写率；2.可以合区分农等电递点只土有0.越01纽奉p宋H单位厕差异套的蛋逢白质哑；3.根据醉其所自在位恭置还顽能够文测定枪蛋白闲质的僻分子今量；4.对很今稀的偏样品疾，最竖后达酱到高讽度的山浓缩喜。87双向决电泳（tw高o-符di产me疮ns删io肢na闹l终ge壶l偿el秀ec劈燕tr蹲op苗ho卫re莫si逢s）第一叛向采改用聚妈丙烯术酸胺块凝胶剧等电隆聚焦渴电泳--PI第二劝向采触用SD瞎S一凝飞胶电乘泳--分子霜量由于损结合庆了蛋浇白质女的等喊电点说和分是子量星两种记完全卸不同的叼特一检性来携进行且分离店，因魄此具菊有非闭常高船的分狗辨率可同扮时分忆析几垄千上描万个蔬蛋白木，分辈辨率汪高，写分离椒度好新。是蛋裳白质踢组学候研究胜的核构心技醋术。88双向PA宪GE89双向贪电泳自技术让缺点踩，具州有以贪下特坦征的革蛋白吓质在局二维台电泳自中还消很难肌被检仁测到龄：①等详电点咳（pl近)值很鼠大或脱很小充的，动比如边大于8和小功于4的那恼些蛋丛白质尖；②分带子质喇量很服大的炸蛋白暂质，版比如想大于l0研0k贷Da的蛋梯白质就安比实通际的雪少了辣，而晶大于15弱0k创Da的蛋赞白质肢就几乎完欧全探丈测不贱到了室（尽弃管在哭一维畏电泳伤凝胶齿上这锻些大蛋欣白质耀都能槽清楚婆地被跪观察腔到；③疏贵水性滥蛋白生质。90免疫业电泳将电泳辅分离和专一努性免松疫沉默淀相结卖合的概分析蔽方法冤：免疫文电泳魔法是晌指利刚用凝依胶电泻泳与恶双向检免疫膊扩散咳两种锹技术凯结合私的实珠验方驴法。向在电位场作险用下慈标本迫中各均组分什因电高泳迁要移率部不同泉而分雀成区到带，牌然后拳沿电泥泳平核行方震向将桥凝胶宋挖一感沟槽现，将疫抗体被加入么沟槽外内，彩使抗骄原与拣抗体愿相互若扩散坟而形侦成沉怖淀线肆。根剧据沉秤淀线输的数乞量、客位置广及形凯状，尖以分胜析标盟本中啦所含杨组分遣的性弟质。由于潮免疫箱反应今有很高德的专潜一性踢，可用瓶于鉴定Pr的纯度衰，分疏析样挂品中蛋绿白质未的组抄分。PH话8越.6本实觉验常卖用于精抗原停分析客及免冷疫性炉疾病学的诊耕断。9192三、煤测定产纯化脉蛋白侦质的滥分子淋大小测定捏蛋白川处于喉非变犬性条跪件下堪的大姑小一锹般可狠通过镜：凝胶汽层析沉降道平衡详超速算离心（se歼di淘me败nt芹at宾io绸neq姓ul输ib笼ri驼umul厅tr筐ac逆en动tr忆if四ug认at辅io扶n)动态剧光散伙射（dy麻na部mi雹c剃li满gh圣t桃sc塞at抛te宅ri节ng剪)孔径姑梯度汉聚丙掩烯酰平胺凝扑胶电贵泳（po咬re午g挤ra汁di泰en脱tpo师ly愁ac僚ry致la紫mi贿dege攀l偷el喷ec咽tr深op胸ho箱re耐si寸s）93凝胶冠层析1.凝胶但是一析类多打孔性漠高分累子聚乞合物,每个吵颗粒幼犹如言一个鸭筛子.当样愈品溶显液通祥过凝围胶柱包时,相对塔分子灰质量胃较大宾的物禾质由鹿于直猜径大屿于凝除胶网赴孔而末只能侵沿着哪凝胶小颗粒佳间的颜孔隙,随着骑溶剂轨流动,因此已流程虚较短,向前慰移动园速度属快而浴首先顷流出屑层析似柱;2.反之,相对吧分子硬质量摔较小远的物丽质由劲于直间径小楼于凝候胶网付孔,可自风由地错进出啦凝胶阶颗粒闹的网非孔,在向腥下移碌动过宾程中,它们那从凝咏胶内拣扩散卡到胶朵粒孔崇隙后脆再进压入另款一凝谊胶颗庸粒,如此绕不断折地进幻玉入与肌逸出,使流幅量增络长,移动颠速率肿慢而绸最后上流出璃层析务柱.943.而中银等大油小的罚分子,它们抄也能洽在凝凑胶颗谷粒内拆外分女布,部分修进入茅颗粒,从而帖在大箩分子暑物质梯与小镇分子茫物质王之间践被洗高脱.这样,经过慨层析妈柱,使混偿合物摔中的俗各物稼质按喘其分圣子大麦小不附同而惩被分妖离雁。Ve＝－b’逐lo天gM己wC’其中b’拐,C’为常腔数。弄即Ve为洗棚脱体剩积，鱼与lo浇gM慌w也成感线性扁关系膀。我亿们可废以通殿过在孟一凝横胶柱跳上分从离多组种已栽知分锻子量忠的蛋根白质辉后，随并根远据上亚述的铃线性粗关系龙绘出庄标准怎曲线齿，然蛋后用槐同一比凝胶友柱测酿出其客它未舅知蛋具白的误分子猎量。95沉降虾平衡精超速睡离心（se锣di弃me顿nt亦at祥io盼neq哑ul浴ib收ri弓umul返tr浇ac蛾en催tr眠if收ug卖at梅io援n)用该催技术恩测定暂蛋白匠质分眯子质叔量的联时候盛，测炎定的俩是几疲个绝惰对动稿力学葵参数啦。96原理谁：当Pr样品钟在相贼对较欢低的皮离心种速度耐（但望还是链处于米超速牲范围悬）下争离心溜时，猫在一愉个从艰离心栗管顶缸部指紫向底秀部的骆、越令往底膜部越素大的艰沉降罗力作标用下珠，Pr分子获很快姐形成既一个真从离衡心管谊顶部悄往下啦逐渐籍增加激的连需续Ｐr浓度铃梯度掀；与征此同窗时，友将有磨一个派方向船与离泽心力恢相反锄的扩职散力眨作用粉于Pr上；嫂当沉厅降离芽心进摊行一第定时眠间之糕后，台作用拔于Pr上的悼离心饺力和芽扩散纪力（寺前者雁与蛋判白在虫离心险管中提所在按位置索离轴剩心的胜距离指成正击比例姐，后宝者与Pr浓度搅成正铜比）禽正好蔽相互翠消除睡，这伟样使扭得蛋腰白样旦品的腿表面处忆于一雕个平残衡状痒态而拔不再弹移动厌；在璃这种救平衡司条件览下，阴不同沟部位Pr浓度岭与所跨在部拾位离凳轴心颜的距惑离之鬼间的龙关系姐与蛋送白质鼓分子馅质量遥成某讽种数坊学关表系。9798动态戚弹性骗光散黑射是通阶过测摩定蛋尘白颗赵粒的鞠直径榨、然叫后与驾标准护蛋白慰样品阅比较努而推妖算蛋堂白分勾子质经量的觉方法区。这种除测定河技术矛也可刮通过艰观察笔样品寸是单析分散蝇性的魔（mo详no颤di抱sp月er固se桐d）还挨是多裳分散讨性的送（po婆ly无di所sp仅er-se厘d）而迈反映恢所测些蛋白笛样品宰是否漏均一斤。99孔径牌梯度底电泳这是胳通过豆制备云具有童一定佣范围苗的从大先到小岁孔径梯度赚的聚丙脑烯酸幸胺凝单胶，然腹后让修蛋白奴在非路变性膨条件交下在赴这种捧凝胶良上电嗽泳而刚进行才的。经过匹低电闻流条失件下币的较月长时柳间的真电泳留，蛋挑白质蔑分子您将在哗凝胶抱中与投其直惨径相渴等的草孔径害处停嚷下（丑因为见再往威下凝弓胶中秒的孔玻径比紧蛋白邻直径域小）遥。通另过与抚同时茧在胶帜中电哗泳的标准徒样品凤比较我们竭就可庆以知滴道蛋棉白在镜这种狸非变瓣性条核件下荷的分耗子质咸量。优点图：１.所获皮得的蝇是天变然状挎态下骡的蛋滚白分框子大跑小。2.如果赚蛋白游分子够能够治在这康种低鞠电流羞电场涂中长时间帽保持搜稳定吴的话点，这显种方换法比佣较闸经济勤。10总0质谱质谱裁是一古种在劣化学庙中被弊广泛施采用减的、捎测定惩原子花或分枝子质修量方懂法中沙最直静接、纷最准泛确的作方法肠。10猴1用质席谱测需定蛋氧白质雪分子约质量坡的总肾的原枪理：首先乒纯化薯好的畜蛋白卡样品妖要被鸽转变抢成挥发贴和带编电（即掌解离身）状疗态，烤电离包后的摧蛋白贞质分触子（亲带有适多个子电荷该）然逮后进苏人一粥个真扩空加园速电熄场中柄，之示后，篮不同熊质荷剪比（m/喜z）的诉蛋白转分子余表现日出的蝇行为〔或者铁在外详加磁扎场中厅的偏塞转、仙或者贸抵达毙固定饥探测恼器的逝所谓挺“飞温行时校间（ti钞me虎o照f抱fl盯ig过ht渴,院TO烂F)察"敬〕不一厦样。室利用万所测兽得的骡质荷雁比以甩及蛋到白所豆带的冬电荷付值，终计算馒机软谅件很脾快就为会正脱确地温给出峰所测讲蛋白斗分子纯的质薯量。10籍2用质盟谱测揪定蛋锣白质膨的分悼子质钢量，雾精确捧一般额可达0.椒01弄%，是惊目前乘进行异蛋白委质分抄子量猫测定倘最准毒确的搭方法叛（其厌准确坊度超胀过SD扁S-竟PA汁GE、弹璃性光白散射晴和孔丹径梯放度聚锋丙烯录酰胺驾凝胶稠电泳脸，甚炕至分弊析超绣速离春心等忧）。质谱僵技术现在孤也可坛直接互用于以：氨基秀酸序傲列的戏测定蛋白挣质的被翻译鹊后修客饰的灶鉴定蛋白冠质组逝学研慢究工较作。10私3四、很测定布蛋白仅质的罗氨基纵酸序氧列蛋白叮质被寨纯化付出来猪，需厚要进禽一步蓬获取勇其基落因序露列，最好菊测定迈其部勿分的航或全换部的承氨基厌酸序震列。自动碑氨基菌酸测例序仪10劲4五、袭用抗屯体探蹲测特签异蛋隆白质寺分子抗体伙是当猫外源丛入侵伴物（驰包括同蛋白门质）樱与脊酸椎动活物体衔内的此免疫盛系统销接触绢后产商生的睛、能迹与入买侵物设特异汁结合拥的防挡御性德蛋白调质分滥子。这种磨高度遵特异庙、高宵度灵导敏的抗体忍一抗纸原结合泊反应洗现在布被广档泛地梳应用及于检测虑微量酱蛋白的存雕在情叮况。10缠5目前乱应用抗体研究宿蛋白锯质的狡方法畅主要肯包括伴下面穷几种到：１.蛋白忧质印变迹2.免疫吵共沉杏淀10到6(一）祥蛋白软质印引迹（We哪st告er都n桨bl允ot膨ti紧ng）是一期种使璃用广炕泛的炼检测睬蛋白累质的筛方法败。这种料方法难与研杏究核饲酸时灯用的泳印迹奏法原墙理非宴常类尿似－复－蛋白哑质印谱迹法是利每用抗葬原一仙抗体排之间杏的特敌异结蜓合反字应而坊检测殊的；核酸所类的泄印迹冠法是利显用核何酸分援子之腰间通渣过特鼠异碱蔽基配讽对法爷则而柄形成徒杂交跳分子强这一猜原理胆而检筛测的10兄7蛋白搞质印走迹－－检测岛时，盗蛋白道质混笋合物摄（一述般是飘细胞该抽提珍物）影通过击电泳坦被分续开，半蛋白选质被抖（一鄙般通碑过电凝场的明作用登）转贸移到疏一种爪特别牙的膜仇（如迷硝化李纤维暂膜等均）上认，然达后让瓣特异逝的抗炸体与沸固定戴在膜时上的呢特异搭抗原搅蛋白茫结合抗原退一抗暴体之斗间结释合的高度委特异夹性使得限用某涌种蛋白质兵分子炼制备哲的特续异抗适体分葡子只锡与膜踪蝶上的堡这种蹄蛋白过质分他子结智合，烧而不阀与膜歼上存日在的贤成千摸上万楚种其当他蛋洁白质剂发生浓相互简作用胆。10拦8结合致了特切异抗鸽体的彩蛋白穗质条抵带可缴以通涂过能柴与结竹合在棍抗原摊蛋白处上的营所谓驳“第核一”柱抗体费结合来的、观被一膛种特急异的鸽酶／芳化学漠发光崭基团洗／荧慈光基仰团／扣放射帽性同该位素悦标记亩的“胁第二志”抗眠体进皂行显本示。这样咳我们畜可以妖知道蔽与特兰异抗型体对紫应的枝抗原舅蛋白庄在检幸测的役蛋白标混合沃物中早是否陷存在解？相斧对量爪是多腹少？鸣如果播蛋白析混合侄物是收通过SD济S-纲PA裹GE分开妻的话中，被起检测摩蛋白陵的分偏子量贷也一汪目了级然。10艘9（二斜）免疫童共沉财淀（co爷im恼mu哨no日pr评ec寸ip贺it加at凳io送n）是一架种在婆体外探测男两个狠蛋白捎分子到之间是否批存在巩特异相互妨作用爪的方嗽法。免疫倍共沉怎淀的敢原理雀：如同果两美个蛋洋白在妹体外嘱系统炎中能谋够发爹生特绑异相尿互作愉用的怒话，侧那么尽当用独两个脖蛋白劲中的饲一个错所对押应的州抗体辅进行羽免疫有沉淀丢的时来候，郑另一填个蛋妈白也娇将同服时被蔑沉淀好下来竿。11园0蛋白怨质的洽结构您分析11烟1蛋白暖质结径构包存括：共价末结构痰和非攀共价率结构静态胁结构渐和动帖态结帮构。一级夜结构空间击结构11贴2一、脾氨基帜酸序谷列测漂定－缘瑞一级拘结构扁的测坦定蛋白狱质的外一级尼结构纱决定赞其高晨级结今构，摆测定颤一个施蛋白攀质的抛一级检结构颠是我何们认能识一智个蛋云白质击结构忽和功锡能的吧前提欢之一悼。11昏3Ed亦ma亚n降解晌法：泰是肽某链或舞蛋白酸质中N-端氨杀基酸弄序列它分析衡方法膊之一毫。由筝菲尔·埃德率曼（Pe推hrEd栏ma咬n）首胶先创柴立。质谱纱技术完－－伯基于侨串联箭质谱榴技术障的Ａ挑Ａ测蕉序方厦法是根便据质丑谱技宫术测杜定多天肽分势子质鸡量的浇极高叙准确棋性这一缓特点印而设捡计的通过灶测定燃蛋白县质的丢氨基吓酸所郑对应渐的DN瘦A编码啦序列修上读出倡（从cD点NA序列追直接裁读出柏，或葛从对货应的究基因泰组DN锦A序列院中的奶外显棵子序省列）11惭4Ed滥ma掩n降解葬法：原理卫：用异情硫氰缎酸苯贺酯（PI竟TC）与蚊待分银析多耳肽的N-端氨糠基在啊碱性旺条件体下反黄应，治生成钱苯氨置基硫奴代甲科酰胺志（PT惊C）的需衍生锐物，请然后粪用酸遵处理讲，关训环，围肽链N-端被哨选择摆性地跨切断缴，得守到N-端氨菜基酸炉残基碰的噻牺唑啉役酮苯幅胺衍恐生物叨。接稻着用谢有机童溶剂舰将该款衍生孤物萃哥取出帐来，乖酸作盖用下袄，该偿衍生旦物不撞稳定早，会们继续程反应阔，形庸成一水个稳惯定的防苯基毁乙内们酰硫渔脲（PT兰H）衍场生物鼓。余骆下肽店链中青的酰拉胺键参不受封影响淋。通危过用HP茎LC或电枣泳法洋分析涂生成嫩的苯鄙乙内陶酰硫严脲（PT筐H-氨基舰酸）燃，可价以鉴颈定出勺是哪绒一个逐氨基期酸。越每反炊应一怒次，姜结果沸是得部到一瞒个去漏掉N-端氨梯基酸欠残基皇的多永肽，拨剩下戏的肽勤链可嫌以进多入下拉一个谁循环沾，继您续发拖生降饥解。11尘5优点疏：能够刚可靠答地测局定肽酱链的30个左紧右氨感基酸概残基骆序列诊，最不多可励以分哲析50造-6职0个氨席基酸吗残基痕。在穗最好丢的条并件下粒，每逗形成疫一次PT西H-氨基辩酸，嚼效率细可保唤持在99劈燕%以上答。而询且此晕法