深圳大学理科选修《遗传学发现》课件 重组DNA

重组DNA大肠埃希菌俗名大肠杆菌是人和动物肠道中最主要的细菌之一是正常菌群的成员出生后数小时就进入肠道，并伴随终生能合成维生素B和K，供人体利用能抑制腐败菌及病原菌（如金黄色葡萄球菌、志贺菌属）真菌（如白念珠菌）的过度增殖异位寄居时可引起肠外感染某些菌株有致病性—消化道感染，导致腹泻等每个人每天平均从粪便中排出1011到1013个可作为粪便污染的检测指标常作为细菌的模式生物广泛用于科学研究基因工程的工具菌生物学性状形态与染色G-

杆菌，1~3µm（短杆菌）两端钝圆、无芽孢有周鞭毛有普通菌毛/性菌毛能运动卫生细菌学检查大肠菌群指37OC24h内发酵乳糖产酸产气包括埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属及肠杆菌属等大肠菌群指数指1000ml被检样品中的大肠菌群数生活饮用水的水质标准coli-index≤3个我国2007年开始实施的卫生标准规定每100ml生活饮用水中，不得检出总大肠菌群、耐热大肠菌群和大肠埃希菌

1、细菌培养--平板培养划线法培养涂布法培养大肠杆菌的培养限制性内切酶EcoRI内切酶限制性内切酶:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。分子剪刀沃纳•阿尔伯1929年生于瑞士。苏黎士工科大学毕业后，在日内瓦大学获得博士学位。1971年起，任巴塞尔大学教授。在研究噬菌体的遗传现象时，成功地分离出DNA的限制性酶和甲基化修饰酶，为此获1978年诺贝尔生理学医学奖。限制—修饰现象Kλ（B）λ（B）：能够在大肠杆菌B菌株上生长的λ噬菌体第一次感染K菌株，形成的噬菌斑很少，生长受寄主限制Kλ（K）存活下来的噬菌体再次感染K菌株，则形成的噬菌斑很多，不受限制EO辆P:锻Ef接fi幅ci亦en轨cyof场p椅la钞ti鞭ng（生宅长在俊不同香寄主怀中的λ噬菌朵体的成斑支率，表家示限日制程泊度）说明K和B菌株熄中存茎在一厨种限劫制系风统可呀排除潜外来量的DN肉A；10-4的存追活率遭是由粮宿主臂限制授系统屿作用向的结雁果产生政这种幸现象皂的原阻因何野在甲基僻化酶哭：能使麻细胞唐自身蔬核酸秋的内桐切酶理识别围序列番的碱滤基甲骨基化电，从猎而使粒自身词核酸照免受构内切盐酶水辱解——细菌块的“努防御兴”系唐统核酸罗内切均酶：识别庭并水撞解外哭源DN啄A（外来革核酸宿在内湖切酶他识别喘序列剂上没葵有甲委基化度修饰心作保苹护）研究置发现瓶：原碍来是溉由两态种酶中配合弱完成浙，一订种是廉起修冒饰作租用的骨甲基姑化酶寄，另家一种蜘是核猜酸内胖切酶限制修饰限制—修饰雷体系Kλ（B）λ（K）λ（B）：沾能够够在大敞肠杆鸡菌B菌株恒上生妹长的λ噬菌炸体Kλ（K）再次奴感染K菌株告，则粗形成哭的噬锤菌斑号很多疫，不课受限兴制（K菌株席已经洒对其宪进行爸了修舒饰）λ（B）噬锦菌体夹感染瓶大肠度杆菌K菌株却后，远其DN萄A大部剑分被聚内切隆酶降堆解了纱，但睛有极究少部丛分能镇在特逆定序袍列甲逢基化锻，避粗免被厘酶解茧，因困此有血少量源噬菌妥斑形滑成。在限托制修扶饰系精统中雀，限制吵作用是指润一定雕类型执的细铃菌可兼以通捡过限霜制性餐酶的敲作用看，破纷坏入蛾侵的掉外源DN盗A（如户噬菌安体DN字A等）斧，使斩得外阴源DN损A对生垃物细放胞的惕入侵星受到宗限制励；而宿裙主细范胞自买身的DN创A分子虏合成遇后，作通过脊修饰吓酶的山作用披：在裹碱基醋中特忠定的朗位置锈上发忘生了佣甲基泊化而副得到赔了修塞饰，爹可免载遭自症身限游制性走酶的诉破坏赚，这朝就是戴限制先修饰尺系统林中修饰惧作用的含敏义。限制—修饰腊体系名，其功能就是对保护虹自身摘的DN疮A，分腰解外汁来的DN勒A，以财保护刑和维阳持自小身遗材传信悦息的氧稳定破，这奏对细慌菌的意生存忧和繁墓衍具靠有重超要意铸义。分类核酸外切酶核酸内切酶核酸酶从核酸链的一端开始，一个接一个地消化降解核苷酸从核酸链分子内部切割3’，5’磷酸二酯键，使之断裂形成小片段核酸桑内切司酶：按限誓制性爽酶的阅组成歼、限挽制和痛修饰疯活性恋、切无断核架酸的粪情况仁不同乐，分日三类门（I，II，II术I），通常永指的扩是II型。命名金法H违i袋nd闲II南I同一夺菌株即中所板含的俘多个胀不同锹的限屑制性远核酸墨内切惯酶如从码流感工嗜血桑杆菌d菌株让（Ha戴em秆op侨hi亦lu例sin宣fl月ue龟nz盏aed）先油后发圈现3种限梢制性住酶，海则分肌别命甜名为Hi战ndI，Hi山ndI某I，Hi洽ndI非II大肠杆菌R菌株REscherichia嗜血流感杆菌d株dinfflluenzaeHaemophiillus株名（型号）种名的头两个字母宿主属名的第一个字母coli前3个字舒母代镰表来狭源的画生物随后1个字居母或婆阿拉化伯数图字代腐表菌竹株最后1个罗呈马字孤母代害表发瓦现或少鉴定雀的次慰序基本址特征识别垮并切斯割双宣链DN喷A（环冬状或动线状遗）分声子中4-猴8b污p的特农定序溪列结构铸特征弦：旋赤转对吹称的植回文迫结构切割稳后产煤生的基末端死：Co舍he贤si茫ve言t擦er住mi谦nu熄s鸟or突B谱lu站nt朋e倦nd（粘挽性末村端或黄平末骄端）Ec工oRI的识鹅别序狐列5’始…G狱C失TG浆A棒A室T竞T主CG批A唤G姜…亿3’3’宵…C蜡G线AC乓T乱T敬A屡A渔GC叛T药C铺…肾5’Ec袋oRI的切温割位湾点质粒质粒流是一引种染色稳体外的皂稳定与遗传固因子惹，大脂小从1~虚20和0k烤b不等遮，为醋双链姓、闭合环的DN肿A分子，并颈以超螺客旋状态勒存在晕于宿主挂细胞中。哲质粒味主要月发现战于细菌、放线杂菌和真菌细胞炉中，惨它具叛有自亡主复制和转录能力忧，能唯在子姻代细胞中保证持恒炕定的宵拷贝布数，递并表浇达所叹携带撒的遗传颈信息。质崖粒的锈复制腥和转劫录要毯依赖阻于宿炒主细宁胞编逗码的旗某些港酶和蛋白测质，如两离开畏宿主礼细胞县则不旬能存独活，驾而宿主即使小没有海它们卧也可零以正开常存神活。写质粒屈的存衰在使岁宿主侦具有避一些依额外艘的特距性，岗如对绝抗生墨素的呈抗性资等。莱德苍伯格摊（19疲25握~2摔00准8），大美国耽遗传倒学家豆。细菌谢遗传熄学的鉴创始黑人之圣一。19吧25年5月23日生叼于美薄国蒙碧特克耐莱市庸。19线44年获哥伦斯比亚捷大学学士洞学位抹，以唇后曾晚在医敞学院坐学习薪，不彼久转伴入耶鲁牺大学，于19累47年获笛博士界学位满。19跟59年起螺任斯坦狂福医助学院教授攻兼遗仁传学崖系主枪任。19诉62年任眨肯尼充迪分简子医毒学实扑验室淡主任际。他在萌耶鲁海大学恢期间杀，发撕现细菌免的遗妻传重经组。19萄46年，畅他和E.借L.塔特搞姆发现午遗传盏重组乡丰的普份遍性沙。19扛52年发恨现细暴菌的F因子。19思52年发乞现沙宁门氏虾菌中尤的普击遍性炭转导央，19蠢53年发晃现大肠盟杆菌的温母和噬相菌体λ在染蛾色体获上占盈有一巩定位尖置。19凯56年发底现λ噬菌爆体能浑进行逐局限偷性转股导。维他们认的研弹究工做作还铅包括犹应用稀细菌顺的有耻性生踢殖和恩转导去进行腰细菌号的免牌疫学算和代贷谢作州用等佣方面怜的研至究。19顷58年他馋和G.迹W.比德蔬尔和E.筝L.塔特平姆共猾同获斜得诺迅贝尔势生理亮学或南医学项奖。接合店现象避的发及现接合哀：指通饥过细纤菌细无胞的箩直接伯接触接，遗币传物间质从供体转移全到受体并发都生重慕组的锻过程系。19密46年莱德暗伯格和塔幻玉特姆发现抱了细菌吼的接协合。细菌拍的杂那交实毒例（19桥46）不同讲营养单缺陷可型的西大肠贩杆菌投（K1胁2）：A菌株万：me牙t-bi依o-th舞r+le怨u+th验i+，B菌株洗：me荒t+bi围o+th芽r-le渠u-th颤i-这种勤野生柔型细童胞如袭何出狼现的江？U型管沟实验猛：A、B菌株份分别升培养磨在基越本培呈养基愉上一边漏加压堤和吸袜引使泻培养药液充要分混榜合结果蚕任何雀一臂争的培辟养基流上均拖未长惨出野景生型书细菌庄。结论携：菌咱株A与菌裤株B细胞乘直接墓接触贸（接闲合）顶是野谷生型毫细胞兵出现弄的必梦要条立件；昌两菌布株直辫接接饿触后枯导致撇遗传同物质伯转移乒，进医而发赠生基魔因重票组，社产生乳野生渐型细列菌。试验金证明堪：接合温过程者是一很种单向致转移，A菌株混遗传煤物质B菌株劳，从钉供体蹲到受督体。用大糖肠杆卡菌K1嗽2的菌放株A和菌牲株B，首艺先用些高剂祝量的链霉库素处理宏菌株A或菌钻株B，把俭处理妻过的鸦菌株A跟未棕处理肿过的予菌株B混合知，或突把处挣理过掀的菌殃株B跟未累处理亩过的柳菌株A混合高，发准现结屿果大途不相余同：⑴们F因子肉：致绕育因饲子或援称性肚因子蚕，是越一种括附加袭体。携带F因子赞的菌简株称接为供粒体菌孤或雄肚性，植用F＋表示智。未携茂带F因子疾的菌问株为扫受体势菌或永雌性胃，用F－表示和。F因子倦及F＋向F－的转万移⑵结F因子克的结哪构染色角体外币遗传纷物质厘（质俊粒）栽，环丛状DN所A，9×1彩04bp，大倚约为妄大肠救杆菌依环状共染色础体的2%，具庙有40潮~6陡0个蛋晕白质丸基因筑。每个不细胞嫩（F＋）有2~加4个。F因子淡分为洗三个傍区域揪：自主勇复制腿区：有邮转移括的起查点和2个复比制起碗点。杂复制购起点Or趋iT是在鞋染色纳体转历移时乏进行滚环劈燕复制时的浪复制寸起点桌；Or项iV是在储营养扮时期殃，即恭游离侵在细光胞质妈中独立伴复制时的姜复制率起点乔。转移崇区：主陡要有唱合成性伞蚕毛即F纤毛（Fpi盯li）的档操纵榨子。F纤毛革是由判性伞毛械蛋白危构成悄，呈很管状罢，又谊叫接魔合管童。通创过接境合管别可将堤供体经和受削体细炒胞相糟联。乎共30峰kb长，就有40个基杨因与DN顾A的转毛移有椒关。重组严区：有4个插急入顺兄序（IS），乘通过脖和宿胁主染志色体上的IS同源雁重组灭或通曾过转葵座，F因子虎可以室整合剑到宿路主不守同位滥点上臣。⑶种F因子或的三场种状令态②有一窗个自陈主状缎态的F因子裹，即F＋细胞睡；③带有乌一个闷整合自的F因子艺的细毛胞叫高频蔑重组凯细胞，Hf绒r细胞破。①没有F因子奇，即F－细胞毁；F＋与F－菌（1）有F因子连的细昂菌称战为F＋，细恶菌增筐殖时宣可把F因子子传递赶给后挠代细驼胞（礼通过死自主青复制颠）。（2）没仁有F因子炼的细对菌称遭为F－，F＋细菌辟经吖模啶橙处税理而下丢失搬，成租为F－。F因子烂一经叨丢失榆，细胞攀中便飞不再执出现贩；（3）F＋可以非和F－杂交鞭，而装不能娘和F＋杂交坝；（4）F＋菌与F－菌混唤合（膜即F＋×F－）1小时希后，敬约95夺%的F－菌转息变为F＋菌，头而原穷来的F＋仍然宪保留裁有F因子垮。(1剃)堆F纤毛时合成辉：由性伞肯毛蛋硬白构成派，接合提管使供值体和踪蝶受体垃细胞拳接触肺。(2过)转移总启动负：F因子验从转烦移复修制起征点(Or专iT)开始沙向F－转移优（5’端首舟先进吸入受佣体）。(3租)单链万转移否，滚胸环复砍制。F纤毛旱与接砍合管F＋×F－Hf此r是F因子霸整合世到E.繁co烈li染色隔体上拾的结投果E.执co童li染色宗体上堡有20个以盾上的助整合叛位点为；整合惧通过IS等同夸源重甩组或劲转座绩实现滑；F因子脊有多唱个整挖合位救点，滋主要甚在IS郊3处。分子拌克隆pU冲C1革8pU集C1帐9含四订个部微分：（1）来浇自pB屈R3扎22的质静粒复杠制起主点（or厘i）；（2）am跳pr;（3）大蜜肠杆率菌β半乳枯糖苷熄酶基考因（la竭cZ’）的新启动雀子及章其编沙码α-肽链笛的DN涝A序列定；（4）多运克隆晕位点迟（MC挖S）la运cZ`Or供iAm驾prMC技S蓝白寨斑筛仪选重寺组子攻的原钟理：la胳cZ’编码β半乳授糖苷境酶的α肽，凤在异勤丙基擦硫代-凯β-贴D-半乳元糖苷闻（IP恐TG）的那诱导熟下，拔使呈希色底草物5-溴-4骑-氯-3辰-吲哚-帮β-穷D-半乳招糖苷掘（X-盏ga元l）被挨分解另产生剥蓝色选。因熔此携庆带空文载体军的大主肠杆售菌呈恩蓝色苍菌落湾。外源倦基因妥的插湿入使α肽失北活，林因而慢携带临外源陈基因用的重哄组子此菌落域呈白线色。利用迷菌落形颜色浅筛选景重组询子PU限C质粒诊