四种外植体遗传转化体系的探究课件

农杆菌介导的不同大豆外植体遗传转化体系的研究导师：王罡教授学生：钟影

时间：2012年11月15日1研究背景及目的意义2研究内容3技术路线4目前工作进展5实验进度及安排研究背景大豆[Glycinemax(L.)Merrill］是世界上最重要的油料作物和高蛋白粮食作物之一，也是人类植物性蛋白和油脂的重要来源并在维持地球生物圈氮循环具有重要的作用。草甘膦（Glyphosate），学名N-(膦酰基甲基)氨基乙酸，只有极少数的杂草对它具有抗性，成为世界上生产使用量最大的除草剂品种。草甘膦作用机理是抑制植物体中5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合成酶（EPSPS）的活性，使植物体芳香族氨基酸合成受阻，致使植物死亡。农杆菌介导的大豆遗传转化是国内外应用最为成熟、操作简便的转化方法。至今，研究者们已经利用大豆子叶节、成熟胚、胚尖、下胚轴、未成熟子叶、初生叶、花絮等获得了转基因大豆再生植株，但不同外植体的转化效率各不相同。其中，尤以子叶节、胚尖两种外植体研究较为深入，子叶节的遗传转化体系最为成熟，但转化效率没有较大突破。目的意义本研究旨在对国内常用的几种大豆外植体遗传转化体系进行系统研究，通过研究在农杆菌介导下，不同类型外植体在不定芽诱导率、植株再生率、除草剂敏感性及基因转化效率等方面的差异，以期获得抗除草剂大豆转基因植株并建立一种相对稳定、高效的的大豆转化体系，为进一步研究改进提供参考，为大豆的转基因育种提供技术支撑。

研究内容不同外植体除草剂筛选浓度的探究大豆胚尖遗传转化体系的优化生长点非离体微创转化体系的探究大豆四种外植体遗传转化体系的探究除草剂筛选浓度探究

基因型：黑农37、合丰35外植体：子叶节、胚尖、下胚轴预期浓度梯度：胚尖：0、2.5、5、7.5、10、12.5mg/L子叶节：0、3、6、9、12、15、20mg/L下胚轴：0、2.5、5、7.5、10、12.5、15mg/L评价指标：不定芽诱导率、不定芽长

研究内容不同外植体除草剂筛选浓度的探究大豆胚尖遗传转化体系的优化生长点非离体微创转化体系的探究大豆四种外植体遗传转化体系的探究胚尖遗传转化体系优化基因型：黑农37、合丰35优化条件超声波辅助转化时间：0、2、4、6、8、10min预培养时间梯度：0、1、2、3d抗氧化剂DTT、硫代硫酸钠、L-cys、硝酸银评价指标不定芽诱导率、基因转化效率、褐化率

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基因型：黑农37、合丰35探究因素：成熟胚培养时间2、3、4、5d(根据胚轴伸长情况而定)重悬液种类无菌水、1/2MS盐、1/10MS盐、MS盐转化位点植株每个位节做PCR检测，为T1代检测做基础评价标准转化率、再生率

研究内容不同外植体除草剂筛选浓度的探究大豆胚尖遗传转化体系的优化生长点非离体微创转化体系的探究大豆四种外植体遗传转化体系的探究四种外植体遗传转化体系的探究

载体：带有EPSPS、Bar基因的PSOY20载体基因型黑农37、合丰35外植体子叶节、胚尖、下胚轴、半种子评价标准不定芽诱导率、植株再生率、除草剂敏感性及基因遗传转化效率总体技术路线分子鉴定挑选大豆氯气消毒挑取农杆菌单菌落接种于YEP中，28℃摇床过夜培养1:10扩大培养，至OD600=0.5~0.6左右侵染共培养筛选、培养收集菌体制备重悬液外植体制备子叶节转化过程胚尖转化过程下胚轴转化流程生长点非离体微创转化体系的研究种子萌发共培养光照预培养植入蛭石目前工作进展黑农37（已经完成）从上到下，从左至右，草甘膦浓度依次为：0、2.5、5、7.5、10、12.5mg/L胚尖遗传体系优化及转化（进入检测阶段）成苗生根微创法（等待T0代种子，T1代检测）现阶段实验进度及安排2012-03～2012-05试验材料准备及农杆菌验证2012-06～2012-08除草剂浓度梯度筛选2012-09～2012-11黑农37四种外植体的转化及微创法实验2012-12～2013-04基因型合丰35四种外植体的转化及T0代播种实验进度及安排2013-05～2013-08胚尖遗传转化体系的优化及T1代检测2013-09～2013