高效液相色谱法

高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatograph------HPLC)药物分析教研室1本文档共83页；当前第1页；编辑于星期三\18点58分

HPLC法以经典LC为基础，引入GC的理论与技术，并加以改进而发展起来的一种分离分析方法。是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，用高压输液系统，将流动相泵入色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。2本文档共83页；当前第2页；编辑于星期三\18点58分【示例10-1】现行《中国药典》二部阿司匹林片剂的含量测定。色谱条件：用十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈-四氢呋喃-冰醋酸-水（20：5：5：70）为流动相；检测波长为276nm。取片剂20片用1%冰醋酸-甲醇溶液精密制成100mL，精密配制阿司匹林0.lg/L对照品溶液，分别精密取供试品与对照品溶液10μL，进行测定。按外标法以峰面积计算，即得。3本文档共83页；当前第3页；编辑于星期三\18点58分HPLC与经典LC的比较相同点：均有四种色谱机理液固吸附色谱(HPLSC)

液液分配色谱(HPLLC)

离子交换色谱(HPIEC)

凝胶色谱(HPGPC)4本文档共83页；当前第4页；编辑于星期三\18点58分不同点:

LCHPLC

固定相

全多孔表面多孔型的无定型全多孔微粒

粒度不均匀不耐高压均匀耐高压

操作压力常压、低压高压

柱效

10-100/m104-106/m

柱长

1-2m10-25cm

柱内径

2-5cm0.2-0.5cm

5本文档共83页；当前第5页；编辑于星期三\18点58分不同点:

LCHPLC

样品用量

1-10g10-6-10-2g分析时间长1-20h10-几十min

装置间断连续、自动化非仪器仪器化精度低精度高6本文档共83页；当前第6页；编辑于星期三\18点58分

10.1高效液相色谱法类型10.2常用固定相与流动相10.3高效液相色谱仪10.4高效液相色谱条件选择10.5应用与实例7本文档共83页；当前第7页；编辑于星期三\18点58分

HPLC特点三高、两广、一少

高效化、高速化、高灵敏度分析范围广、流动相选择范围广样品用量少色谱柱可反复使用、流出组分易收集、安全8本文档共83页；当前第8页；编辑于星期三\18点58分HPLC类型按实验目的

分析型（ϕ1～6：4.6、2.1mm）

制备型（ϕ10～500mm）按分离机制9本文档共83页；当前第9页；编辑于星期三\18点58分按分离机制10本文档共83页；当前第10页；编辑于星期三\18点58分HPLC类型反相键合相色谱法反相离子抑制色谱法反相离子对色谱法手性色谱法亲和色谱法11本文档共83页；当前第11页；编辑于星期三\18点58分

液-固吸附色谱固定相

HPLC固定相主要用硅胶。（1)无定形全多孔硅胶：YWG(2)球形全多孔硅胶：YQG(3）堆积硅珠：YQG高分子多孔微球：YSG12本文档共83页；当前第12页；编辑于星期三\18点58分化学键合相色谱固定相将固定液的官能团键合在载体的表面而构成化学键合相。以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法(BPC)，简称键合相色谱法。

13本文档共83页；当前第13页；编辑于星期三\18点58分化学键合相的形成14本文档共83页；当前第14页；编辑于星期三\18点58分性能指标1）覆盖率指参与反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。覆盖率的大小决定键合相是分配还是吸附占主导。（2）含碳量(C%)表示键合相的键合量，与键合反应及表面覆盖率有关。高碳、中碳及低碳型15本文档共83页；当前第15页；编辑于星期三\18点58分

特点机理：吸附&分配化学键合相色谱法（BPC）化学键合相的优点：使用过程不流失，耐溶剂冲洗化学性质稳定，柱子不娇

热稳定性好载样量大适用于梯度洗脱16本文档共83页；当前第16页；编辑于星期三\18点58分

化学键合相的类型全多孔硅胶为基体键合相的表面结构：单分子键合Si-O-C，Si-O-Si-C

聚合键合Si-O-Si-C结合的化学键类型：

Si-O-C、Si-N、Si-C、Si-O-Si-C极性：非极性、中等极性、极性

17本文档共83页；当前第17页；编辑于星期三\18点58分

1)非极性键合相：表面基团为非极性烃基，C18、C8、甲基、苯基等，用作反相色谱的固定相。最常用的非极性键合相是十八烷基键合相（ODS键合相），洗脱剂多为强极性溶剂，如水、醇、乙腈或无机盐缓冲液。常用CH3OH—H2O作流动相，极性大先出峰，极性小后出峰。18本文档共83页；当前第18页；编辑于星期三\18点58分反相色谱常用的微粒键合相

官能团

载体

颗粒直径十八烷基

Zorbax3~10um辛烷基

Nucleosil100A3~10um苯基

mporasil~7um二甲硅烷

Lichrosorb3~10um19本文档共83页；当前第19页；编辑于星期三\18点58分

2)中等极性键合相常用的有醚基键合相，既可作正相又可作反相色谱的固定相，视流动相的极性而定。20本文档共83页；当前第20页；编辑于星期三\18点58分

3)极性键合相常用氨基、氰基键合相。可用作正相色谱的固定相，洗脱剂常用非极性或弱极性溶剂，加入适量的极性溶剂，以调节洗脱强度。极性小的先出峰，极性大的后出峰。21本文档共83页；当前第21页；编辑于星期三\18点58分正相色谱常用固定相结构氰基

-(CH2)3C=N氨基

-(CH2)nNH2(n=3or4)二醇

-(CH2)3OCH(OH)CH2OH二甲氨基

-(CH2)3N(CH3)2二氨基

-(CH2)3NH(CH2)2NH2本文档共83页；当前第22页；编辑于星期三\18点58分常用流动相及其选择选择流动相：（1）化学性质稳定。（2）粘度小。（3）溶剂的纯度要高。（4）沸点低（制备型）。（5）与色谱系统的适应性好。23本文档共83页；当前第23页；编辑于星期三\18点58分液固色谱流动相选择原则极性大的试样用极性强的洗脱剂极性小的试样用极性弱的洗脱剂洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度(ε0)参数来衡量；分离复杂试样，采用梯度洗脱。24本文档共83页；当前第24页；编辑于星期三\18点58分液固色谱中流动相的选择(1)强溶剂

与硅胶表面活性位置结合能力强的溶剂，洗脱溶质分子的能力也强。(2)弱溶剂

与硅胶表面活性位置结合能力弱的溶剂，洗脱溶质分子的能力也弱。(3)结合能eoeo值越大，溶剂为强溶剂。常用：正已烷、异辛烷、氯仿、异丙醇、乙腈等。(4)eo的特点

溶剂强度与溶剂的体积百分比不成线性关系。(5)含水量的控制

通过有机修饰剂的调节，控制硅胶的含水量。25本文档共83页；当前第25页；编辑于星期三\18点58分反相色谱流动相注意：A缓冲离子不能产生沉淀。B溶剂的紫外切点必须小于所使用的检测波长。C避免使用卤族离子。DpH调节在2~7.5之间。不能超过7.5，否则硅胶将被溶解！26本文档共83页；当前第26页；编辑于星期三\18点58分反相色谱的流动相最常用：水、甲醇、乙腈、丙酮、异丙醇、四氢呋喃等。主要组成是水，极性和表面张力最高，最弱的流动相，以此洗脱非极性组分时，表现出的滞留时间最长。甲醇和乙腈，是最常用的调节剂。（因为甲醇和乙腈的紫外切点相对较低，且粘度较小，及易于提纯。）规律：水量越高，保留时间越长。27本文档共83页；当前第27页；编辑于星期三\18点58分规律①组分分子结构对保留值的影响：组分的保留值与其分子中非极性部分的总表面积越大，保留值也越大。②烷基键合相的特性对保留值的影响：随碳链的加长，组分的保留值增加，对组分分离的选择性也增加。③流动相性质对保留值的影响：流动相的表面张力越大、介电常数越大，其极性越强，流动相的洗脱强度越弱，组分的保留值越大。28本文档共83页；当前第28页；编辑于星期三\18点58分正相色谱的流动相

正相色谱的流动相最常用的是烷烃溶剂。如：正戊烷、正己烷、正庚烷、环已烷等。

流动相的极性越强洗脱能力越强，也就是强溶剂。反之为弱溶液剂。本文档共83页；当前第29页；编辑于星期三\18点58分

本文档共83页；当前第30页；编辑于星期三\18点58分液-固色谱的应用(1)主要用于脂溶性化合物的分离：如磷脂、甾体化合物、脂溶性维生素、前列腺素等。(2)分离几何异构体：

如维生素A的几何异构体。(3)分类分离（族的分离）：从非极性很强的甾醇化合物到极性很强的磷脂酸。一般来讲，溶解于有机溶剂的样品可得到最佳分离，而强极性或离子型样品常常得不到令人满意的结果。31本文档共83页；当前第31页；编辑于星期三\18点58分反相色谱的应用可分离极性到非极性的各种化合物。A氨基酸、多肽和蛋白质的分离。B碱基、核苷和核苷酸的分离。C甾体化合物的分离。D其它：儿茶酚胺、组胺、糖类、维生素、酶等。

32本文档共83页；当前第32页；编辑于星期三\18点58分反相色谱的特点A适于分离带有不同疏水基团的化合物。B可通过改变溶剂组成和pH，来分离不同极性的化合物。C可分离从极性到非极性的宽范围的化合物。33本文档共83页；当前第33页；编辑于星期三\18点58分正相色谱的应用正相色谱适用于分离极性化合物。如：酚类、胺类、多环化合物、染料、炸药、羟基化合物、氨基酸和药物等。这些样品在正己烷或其它烷烃溶剂中的溶解度很小，在极性溶剂中的溶解度良好。用正相色谱分离可得到较好的效果。

在使用正相色谱时一个值得注意的问题是在用氨基作固定相分离糖时，一些还原糖容易与固定相的氨基发生化学反应，产生席夫碱（Schiffsbase)。本文档共83页；当前第34页；编辑于星期三\18点58分10.3

HPLC色谱仪HPLC仪组成主要部件及功能35本文档共83页；当前第35页；编辑于星期三\18点58分

HPLC仪组成高压输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统36本文档共83页；当前第36页；编辑于星期三\18点58分HPLC的组成及工作流程1螺旋注射泵

2往复柱塞泵

3往复隔膜泵

4气动放大泵1自动进样器

2手动进样器1液固

2液液

3离子交换

4空间排阻1紫外检测器

2荧光检测器

3示差折光检测器

4电化学检测器

5电导检测器

6放射性检测器色谱柱“心脏”37本文档共83页；当前第37页；编辑于星期三\18点58分38本文档共83页；当前第38页；编辑于星期三\18点58分

主要部件

(一)输液泵

(二)进样器

(三)色谱柱

(四)检测器39本文档共83页；当前第39页；编辑于星期三\18点58分

(一)输液泵高压输液系统泵的类别对泵的要求泵的保养40本文档共83页；当前第40页；编辑于星期三\18点58分1.高压输液系统

储液罐脱气装置过滤器高压输液泵梯度洗脱装置压力脉动阻滞器关键41本文档共83页；当前第41页；编辑于星期三\18点58分

2.泵的类别螺旋注射泵往复柱塞泵往复隔膜泵气动放大泵42本文档共83页；当前第42页；编辑于星期三\18点58分

3.对泵的要求流量恒定，精密度高±1%输出压力高，平稳流量范围宽0.01-10ml/min

制备液相流速较高耐高压耐腐蚀泵体易于清洗43本文档共83页；当前第43页；编辑于星期三\18点58分

4.泵的保养如果流动相有酸、碱、盐等缓冲体系，必须用水冲洗。如果压力过大，混合器可用6mol/LHNO3超声，再用水超声。对仪器的拆卸应在仪器负责人或厂家工程师的指导下进行。观察有无漏液44本文档共83页；当前第44页；编辑于星期三\18点58分(二)进样针

手动

高压进样阀注射器进样自动

自动进样器

圆盘式自动进样器

链式自动进样器45本文档共83页；当前第45页；编辑于星期三\18点58分六通阀手动进样器

46本文档共83页；当前第46页；编辑于星期三\18点58分

（Load）

（Inject）

47本文档共83页；当前第47页；编辑于星期三\18点58分48本文档共83页；当前第48页；编辑于星期三\18点58分

(三)色谱柱色谱柱由柱管和固定相组成。对柱的要求:

承受高压、对流动相呈化学惰性、对样品的Rs大柱容量大、分析速度快49本文档共83页；当前第49页；编辑于星期三\18点58分

1.色谱柱尺寸2.色谱柱的装填3.色谱柱柱效的评价4.色谱柱的保养5.柱温箱50本文档共83页；当前第50页；编辑于星期三\18点58分1.色谱柱尺寸分析型：Ø5mm或4.6mm制备型：Ø＞5mm以上微径柱：Ø<2mm柱长：10～25cm，30cm很少见柱体：直型优质不锈钢柱管51本文档共83页；当前第51页；编辑于星期三\18点58分2.色谱柱的装填1)方法干法装柱、匀浆法装柱2)装柱要求均匀紧密、不破坏颗粒、不形成裂缝、颗粒粗细不可分级52本文档共83页；当前第52页；编辑于星期三\18点58分3.色谱柱柱效的评价最小理论塔板数n＞104分离度R≥1.5拖尾因子相对保留值的再现性53本文档共83页；当前第53页；编辑于星期三\18点58分4.色谱柱的保养注意流动相的纯化防止堵塞和污染柱的操作压力＜装填柱的压力应该用进样阀进样防止柱的反冲贮存色谱柱时应防止干涸使用保护（预）柱54本文档共83页；当前第54页；编辑于星期三\18点58分5.柱温箱采用循环空气浴周围环境要保持恒定55本文档共83页；当前第55页；编辑于星期三\18点58分(四)检测器对检测器的要求检测器分类56本文档共83页；当前第56页；编辑于星期三\18点58分

1.对检测器的要求灵敏度高噪音低线性范围宽重复性好适用化合物的种类广57本文档共83页；当前第57页；编辑于星期三\18点58分2.检测器分类选择性检测器

——组分性质检测器通用型检测器

——总体性检测器58本文档共83页；当前第58页；编辑于星期三\18点58分

紫外(UVD)

选择性检测器

荧光(FD)

电化学(ECD)

59本文档共83页；当前第59页；编辑于星期三\18点58分

通用型检测器蒸发激光散射检测器(ELSD)示差折光检测器(RID)质谱检测器(MS)60本文档共83页；当前第60页；编辑于星期三\18点58分

(1)紫外检测器(UVD)1)原理：被测组分对指定波长的紫外光的选择性吸收固定波长型2)类型可变波长型

扫描型

光电二极管阵列(DAD)61本文档共83页；当前第61页；编辑于星期三\18点58分

3)特点:灵敏度高、噪音低；不破坏样品、能与其他DET串联，可用于制备；对温度及流动相流速波动不敏感，可用于梯度淋洗4)弱点:只能检测有UV吸收的样品；流动相的选择有一定的限制62本文档共83页；当前第62页；编辑于星期三\18点58分(2)蒸发光散射检测器(ELSD)

1)原理：粒子对光的散射2)组成：喷嘴、漂移管、光电管3)定量依据：E=Kmn63本文档共83页；当前第63页；编辑于星期三\18点58分(3)荧光检测器1)原理：物质分子的荧光吸收2)优点：固有的灵敏度和选择性3)缺点：应用不广泛64本文档共83页；当前第64页；编辑于星期三\18点58分(4)其他检测器示差折光检测器(RID)电化学检测器(ECD)红外检测器介电常数检测器放射性检测器

MS检测器

NHM检测器65本文档共83页；当前第65页；编辑于星期三\18点58分高效液相色谱条件选择1、柱内展宽

涡流扩散项A纵向扩散项B/u

提高柱效方法流动的流动相的传质阻力项Csmu静态流动相的传质阻力项Csmu

固定相的传质阻力项Csu

2.柱外展宽提高柱效方法66本文档共83页；当前第66页；编辑于星期三\18点58分选择流动相溶剂的原则k2的大小主要取决于流动相溶剂的极性

α主要取决于流动相溶剂的选择性改善分离度的方法

67本文档共83页；当前第67页；编辑于星期三\18点58分实验条件对分离的影响A温度：反相色谱流动相当为含有机溶剂的水溶液时，粘度较高，最好在较高柱温下操作，以减少粘度，柱温一般在30~400C。最高可达800C。BpH值：对于可溶解的组分，改变流动相

pH值，可以改变分离的选择性，采用一定pH值的缓冲溶液作流动相，可以抑制组分的离解。减少峰的拖尾。68本文档共83页；当前第68页；编辑于星期三\18点58分

注意流动相：物理性质极性选择性使用前处理69本文档共83页；当前第69页；编辑于星期三\18点58分

物理性质（1）对检测器的适应性（2）溶剂的粘度和沸点（3）溶解特性70本文档共83页；当前第70页；编辑于星期三\18点58分

流动相的物理性质（1）对检测器的适应性：

示差折光检测器：流动相的折射率与样品折射率有差别。折射率差别越大检测器的灵敏度越高。

紫外检测器：必须选择紫外切点小于检测器波长的溶剂作流动相。

荧光检测器：流动相的紫外切点必须小于检测器所使用的激发光波长，流动相不能引起荧光淬灭。71本文档共83页；当前第71页；编辑于星期三\18点58分流动相的物理性质（2）溶剂的粘度和沸点：溶剂的粘度影响色谱分析的分辨率：在色谱分析中尽量选择粘度小的溶剂，提高分辨率。但溶剂的粘度小往往沸点也低，容易挥发，在色谱过程中容易产生气泡，干扰检测器的工作；在使用两种不同溶剂的混合物做流动相时，还容易改变不同溶剂的比例，降低分析结果的重现性。因此沸点过低的溶剂不适宜做流动相，流动相的沸点至少应比色谱分析的温度高30度。72本文档共83页；当前第72页；编辑于星期三\18点58分

如：

乙醇的价格虽低，但粘度较大沸点略高；

甲醇的粘度较小沸点最低，价格适中；

乙腈的粘度最小沸点较低，但价格较高；

在HPLC中常用甲醇作流动相。73本文档共83页；当前第73页；编辑于星期三\18点58分

流动相的物理性质（3）溶解特性：

HPLC要求组成流动相的溶剂彼此能够互相溶解。74本文档共83页；当前第74页；编辑于星期三\18点58分75本文档共83页；当前第75页；编辑于星期三\18点58分

溶剂的极性

溶剂的极性：溶剂分子与溶质分子间的相互作用能力的大小。这种能