细胞计数方法-细胞计数板法

细胞计数方法------细胞计数板法实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。具体操作：1.将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。2.将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。3.计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算：细胞数/mL=四大格细胞总数/4×10个/ml(注：当细胞很多时，可在四个格中选一定数目较平均的小格，由于每大格中有16个小格，然后计左侧和上方的细胞数，求出每小格的细胞数，取平均值m，m×16即每个格的平均值。所以，细胞密度=m×16×10个/ml)说明：公式中除以4，因为计数了4个大格的细胞数。公式中乘以10因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）=0.1mm而1ml=1000ul=1000mm（注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。）================================================细胞计数板的使用一、血球计数板-基本构造血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有四个槽构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大格，中央的一大格作为计数用，称为计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。计数区边长为1mm，则计数区的面积为1mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。使用细胞计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。二、细胞计数板-使用方法1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释100倍），以每小格的菌数可数为度。2．取洁净的细胞计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。3．将菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上（不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高），然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。4．静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将细胞计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央1个大方格的菌数（即80个小格）。方法有待探讨。UsingaCountingChamberFormicrobiology,cellculture,andmanyapplicationsthatrequireuseofsuspensionsofcellsitisnecessarytodeterminecellconcentration.Onecanoftendeterminecelldensityofasuspensionspectrophotometrically,howeverthatformofdeterminationdoesnotallowanassessmentofcellviability,norcanonedistinguishcelltypes.Adeviceusedfordeterminingthenumberofcellsperunitvolumeofasuspensioniscalledacountingchamber.Themostwidelyusedtypeofchamberiscalledahemocytometer,sinceitwasoriginallydesignedforperformingbloodcellcounts.

Topreparethecountingchamberthemirror-likepolishedsurfaceiscarefullycleanedwithlenspaper.Thecoverslipisalsocleaned.Coverslipsforcountingchambersarespeciallymadeandarethickerthanthoseforconventionalmicroscopy,sincetheymustbeheavyenoughtoovercomethesurfacetensionofadropofliquid.Thecoverslipisplacedoverthecountingsurfacepriortoputtingonthecellsuspension.ThesuspensionisintroducedintooneoftheV-shapedwellswithapasteurorothertypeofpipet.Theareaunderthecoverslipfillsbycapillaryaction.Enoughliquidshouldbeintroducedsothatthemirroredsurfaceisjustcovered.Thechargedcountingchamberisthenplacedonthemicroscopestageandthecountinggridisbroughtintofocusatlowpower.Itisessentialtobeextremelycarefulwithhigherpowerobjectives,sincethecountingchamberismuchthickerthanaconventionalslide.Thechamberoranobjectivelensmaybedamagediftheuserisnotnotcareful.OneentiregridonstandardhemacytometerswithNeubauerrulingscanbeseenat40x(4xobjective).Themaindivisionsseparatethegridinto9largesquares(likeatic-tac-toegrid).Eachsquarehasasurfaceareaofonesquaremm,andthedepthofthechamberis0.1mm.Thustheentirecountinggridliesunderavolumeof0.9mm-cubedSuspensionsshouldbediluteenoughsothatthecellsorotherparticlesdonotoverlapeachotheronthegrid,andshouldbeuniformlydistributed.Toperformthecount,determinethemagnificationneededtorecognizethedesiredcelltype.Nowsystematicallycountthecellsinselectedsquaressothatthetotalcountis100cellsorso(numberofcellsneededforastatisticallysignificantcount).Forlargecellsthismaymeancountingthefourlargecornersquaresandthemiddleone.Foradensesuspensionofsmallcellsyoumaywishtocountthecellsinthefour1/25sq.mmcornersplusthemiddlesquareinthecentralsquare.Alwaysdecideonaspecificcountingpattertoavoidbias.Forcellsthatoverlaparuling,countacellas"in"ifitoverlapsthetoporrightruling,and"out"ifitoverlapsthebottomorleftruling.

HereisawaytodetermineaparticlecountusingaNeubauerhemocytometer.Supposethatyouconductacountasdescribedabove,andcount187particlesinthefivesmallsquaresdescribed.Eachsquarehasanareaof1/25mm-squared(thatis,0.04mm-squared)anddepthof0.1mm.Thetotalvolumeineachsquareis(0.04)x(0.1)=0.004mm-cubed.Youhavefivesquareswithcombinedvolumeof5x(0.004)=0.02mm-cubed.Thusyoucounted187particlesinavolumeof0.02mm-cubed,givingyou187/(0.02)=9350particlespermm-cubed.Thereare1000cubicmillimetersinonecubiccentimeter(sameasamilliliter),soyourparticlecountis9,350,000perml.Cellsareoftenlargeenoughtorequirecountingoveralargersurfacearea.Forexample,youmightcountthetotalnumberofcellsinthefourlargecornersquaresplusthemiddlecombined.Eachsquarehassurfaceareaof1mm-squaredandadepthof0.1mm,givingitavolumeof0.1mm-cubed.Supposethatyoucounted125cells(total)inthefivesquares.Youthenhave125cellsper0.5mm-cubed,whichis250cells/mm-cubed.Again,multiplyby1000todeterminecellcountperml(250,000).Sometimesyouwillneedtodiluteacellsuspensiontogetthecelldensitylowenoughforcounting.Inthatcaseyouwillneedtomultiplyyourfinalcountbyth