微生物的实验室培养课件

微生物包括哪五类：病毒细菌放线菌真菌原生动物特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.原核生物界原生生物界真菌界病毒界微生物基础知识本文档共60页；当前第1页；编辑于星期二\1点45分病毒几乎可以感染所有的细胞生物，并具有宿主特异性噬菌体植物病毒动物病毒微生物基础知识本文档共60页；当前第2页；编辑于星期二\1点45分病毒培养动物接种鸡胚接种（常用的病毒培养法之一）组织培养（应用最广的方法）微生物基础知识本文档共60页；当前第3页；编辑于星期二\1点45分一、基础知识：（一）培养基

培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。（1）按物理状态来分：培养基可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基。其中固体培养基用于菌种分离、鉴定等。（2）按功能来分，可分为选择培养基和鉴别培养基。（3）按成分来分，可分为天然培养基和合成培养基。1.培养基的类型和用途本文档共60页；当前第4页；编辑于星期二\1点45分培养基的种类液体培养基半固体培养基固体培养基据物理性质分天然培养基合成培养基据化学成分分选择培养基鉴别培养基据用途分常用于工业生产常用于观察微生物的运动、鉴定菌种用于微生物的分离、计数常用于工业生产常用于分类、鉴定在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。例如，在培养基中加入青霉素，以抑制细菌、放线菌的生长，从而分离到酵母菌和霉菌。又如，在培养基中加入高浓度的食盐可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长。根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成，用以鉴别不同种类的微生物。例如，在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌：如果有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红和美蓝结合，使菌落呈深紫色，并带有金属光泽。本文档共60页；当前第5页；编辑于星期二\1点45分固体培养基：菌落本文档共60页；当前第6页；编辑于星期二\1点45分液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长本文档共60页；当前第7页；编辑于星期二\1点45分半固体培养基：无动力有动力(弥散)(是否运动)

本文档共60页；当前第8页；编辑于星期二\1点45分2、培养基配制原则：

（1）目的要明确：根据微生物的种类、培养目的等确定配制培养基的种类，因为不同的微生物对培养物质的需求不同。（2）营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。（3）pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同。细菌pH为：；放线菌pH为：；真菌pH为：。本文档共60页；当前第9页；编辑于星期二\1点45分3、培养基的营养构成不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、无机盐等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。

本文档共60页；当前第10页；编辑于星期二\1点45分4、微生物的五种营养要素碳源（carbonsource）

氮源（nitrogensource）

生长因子（growthfactor）

无机盐（mineralsalts）

水（wahtor）

Cncnc-micro本文档共60页；当前第11页；编辑于星期二\1点45分凡能为微生物提供生长繁殖所需碳元素的营养物质都称为碳源。Cncnc-micro碳源本文档共60页；当前第12页；编辑于星期二\1点45分C素构成细胞及代谢产物的骨架C素是大多数微生物代谢所需的能量来源自养微生物以二氧化碳或碳酸盐为唯一碳源进行代谢生长；异养微生物必须以有机物作为碳源进行代谢生长。碳源是异养微生物的主要能源物质。碳源功能本文档共60页；当前第13页；编辑于星期二\1点45分无机C源：CO2、碳酸盐，只能被自养微生物利用有机C源：各种糖类，其次是有机酸、醇类、脂类和烃类化合物碳源种类Cncnc-micro本文档共60页；当前第14页；编辑于星期二\1点45分

凡是能为微生物提供所需氮元素的营养物质都称为氮源。氮源Cncnc-micro本文档共60页；当前第15页；编辑于星期二\1点45分

为微生物提供合成细胞物质代谢产物的原料对许多微生物来说，既可利用无机态氮，也可利用有机态氮。

固氮微生物可以利用氮气作为氮源进行生长。某些种类的氮源也能为微生物提供能量，如NH3既是硝化细菌的氮源又是能源，含C、H、O、N的蛋白质等也能为微生物提供能量。氮源功能Cncnc-micro本文档共60页；当前第16页；编辑于星期二\1点45分分子态氮：固氮微生物以分子氮为唯一氮源无机态氮：硝酸盐、铵盐几乎所有微生物能利用有机态氮：蛋白质及其降解产物

a实验室常用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏做氮源

b生产用玉米浆、豆饼、葵花饼、花生饼等氮源种类Cncnc-micro本文档共60页；当前第17页；编辑于星期二\1点45分

构成微生物细胞的组成成分调解微生物细胞的渗透压，PH值和氧化还原电位有些无机盐如S、Fe还可做为自养微生物的能源构成酶活性基的组成成分，维持酶活性。Mg、Ca、K是多种酶的激活剂无机盐无机盐功能Cncnc-micro本文档共60页；当前第18页；编辑于星期二\1点45分

构成微生物细胞以C、H、O、N、P、S六种元素为主，约占细胞干重的95％以上；

Ca、K、Mg、Fe为大量元素，以无机盐阳离子形式被吸收，配培养基要加磷酸盐、硫酸盐。

Zn、Ca、Mn、Co、Mo等微量元素，在微生物培养中有0.1PPM就可以了，自来水原料中已够用，不需另加。无机盐种类Cncnc-micro本文档共60页；当前第19页；编辑于星期二\1点45分

微生物生长不可缺少的微量有机物质叫生长因子。维生素

氨基酸碱基Cncnc-micro生长因子本文档共60页；当前第20页；编辑于星期二\1点45分

有的微生物自己不能合成维生素，需要外加，主要是B族维生素、硫胺素、叶酸、泛酸、核黄素等，如生产味精需加生物素（是B族中的一种即VH）。维生素Cncnc-micro本文档共60页；当前第21页；编辑于星期二\1点45分

有些微生物自己不能合成某种氨基酸，必须给予补充，如赖AA发酵所用的黄色短杆菌不能合成环丝AA，为环丝AA缺陷型菌株，在培养基中必须添加含环丝AA的氮源。如豆饼水解液或毛发水解液等。氨基酸Cncnc-micro本文档共60页；当前第22页；编辑于星期二\1点45分

嘧啶和嘌呤是核酸和辅酶的重要组分，是许多微生物必须的生长因素。有些微生物不仅不能合成嘧啶和嘌呤，而且不能将补充的嘧啶和嘌呤结合在核苷酸上，还必须供给核苷酸，有的菌需补充卟啉或其衍生物，还有的菌需供给（低碳）脂肪酸等。碱基Cncnc-micro本文档共60页；当前第23页；编辑于星期二\1点45分水Cncnc-micro

是细胞中生化反应的良好介质；营养物质和代谢产物都必须溶解在水里，才能被吸收或排出体（细胞）外。水的比热高，能有效的吸收代谢过程中放出的热量，不致使细胞的温度骤然上升。维持细胞的膨压（控制细胞形态）。本文档共60页；当前第24页；编辑于星期二\1点45分碳源、氮源、生长因子的比较来源常用原料功能碳源CO2、NaHCO3、糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等糖类构成细胞物质和一些代谢产物，有些还是做异养生物的主要能源物质氮源N2、NH3、铵盐、硝酸盐、尿素、牛肉膏和蛋白胨等铵盐、硝酸盐等合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物生长因子维生素、氨基酸、碱基酶、核酸等的组成成分本文档共60页；当前第25页；编辑于星期二\1点45分选择培养基加入青霉素的培养基:

分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:

分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:

分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:

分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基:

分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基:

分离杂交瘤细胞本文档共60页；当前第26页；编辑于星期二\1点45分

根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。

优点：标准化生产，组分和含量相对固定;成本低缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。合成培养基:本文档共60页；当前第27页；编辑于星期二\1点45分天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;天然培养基：本文档共60页；当前第28页；编辑于星期二\1点45分（二）无菌技术1.无菌技术的概念

无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。无论是随后将要学到的倒平板、平板划线操作，还是平板稀释涂布法，其操作中的每一步都需要做到“无菌”，即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。本文档共60页；当前第29页；编辑于星期二\1点45分

（１）消毒定义：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。2.消毒与灭菌的概念及两者的区别

本文档共60页；当前第30页；编辑于星期二\1点45分

（2）灭菌的定义：

是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括所有细菌的孢子、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌之过程。

灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。本文档共60页；当前第31页；编辑于星期二\1点45分比较项理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽孢和孢子能否被消灭消毒较为温和部分生活状态的微生物不能灭菌强烈全部微生物能消毒与灭菌的比较本文档共60页；当前第32页；编辑于星期二\1点45分1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化学药剂消毒法:用75%酒精，氯气消毒水源4、紫外线消毒……(1)消毒的方法：3.常用的消毒与灭菌的方法本文档共60页；当前第33页；编辑于星期二\1点45分1、灼烧灭菌接种环、接种针、试管口2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.(2)灭菌的方法：本文档共60页；当前第34页；编辑于星期二\1点45分

最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。培养微生物的培养皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。

本文档共60页；当前第35页；编辑于星期二\1点45分1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。旁栏思考本文档共60页；当前第36页；编辑于星期二\1点45分3.微生物实验室培养的基本操作程序1、器具的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存本文档共60页；当前第37页；编辑于星期二\1点45分三、实验操作（一.）制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）本文档共60页；当前第38页；编辑于星期二\1点45分1．计算、称量2．溶化3．调pH：pH7．6

4．过滤：这一步可以省去。5．分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。6．加塞7．包扎操作步骤本文档共60页；当前第39页；编辑于星期二\1点45分8．灭菌:

将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160～170℃下灭菌2h。9．倒平板:

待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种.10．无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。本文档共60页；当前第40页；编辑于星期二\1点45分倒平板技术本文档共60页；当前第41页；编辑于星期二\1点45分1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？问题讨论答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。本文档共60页；当前第42页；编辑于星期二\1点45分3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。本文档共60页；当前第43页；编辑于星期二\1点45分（二）、纯化大肠杆菌接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法

平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面.

在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.微生物的接种技术本文档共60页；当前第44页；编辑于星期二\1点45分菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。本文档共60页；当前第45页；编辑于星期二\1点45分菌落细菌的菌落特征因种而异本文档共60页；当前第46页；编辑于星期二\1点45分霉菌的菌落特征因种而异菌落本文档共60页；当前第47页；编辑于星期二\1点45分本文档共60页；当前第48页；编辑于星期二\1点45分问题讨论

1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？

答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。本文档共60页；当前第49页；编辑于星期二\1点45分

2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。

3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？

答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。本文档共60页；当前第50页；编辑于星期二\1点45分本文档共60页；当前第51页；编辑于星期二\1点45分本文档共60页；当前第52页；编辑于星期二\1点45分问题讨论

涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？

应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。本文档共60页；当前第53页；编辑于星期二\1点45分微生物的恒温培养微生物的恒温培养本文档共60页；当前第54页；编辑于星期二\1点45分四、课题成果评价

（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。本文档共60页；当前第5