DNA复制与RNA转录PPT专业课件

DNA复制DNA是遗传物质基因是DNA分子中各种核苷酸排列组成的一定片段(一个功能区域）。DNA具有贮存、传递（包括复制、转录）、接受（如反转录）遗传信息的功能，并与RNA，Pr间存在下列关系：—分子生物学的中心法则（centraldogma）CentralDogma一、DNA复制原核生物一个染色体真核生物多个染色体染色体外遗传因子

细菌的质粒真核生物的细胞器寄生生物的DNA一）DNA

的半保留复制ATCG

一）DNA的复制方式—半保留复制Watson,Crick提出的复制DNA的机制—半保留复制1、半保留复制

—DNA两条链都作为模板合成两条新链半保留复制:DNA复制时两条互补链分开,以每条链为模板,按碱基配对规律形成互补的新链以组成2个新DNA分子,每个子代DNA中的一条链来自亲代,另一条则是新合成的,这种复制方式称为半保留复制.二）DNA复制的起点与方式复制子：基因组能独立进行复制的单位称为复制子每个复制子含有复制起点—控制复制起始复制终点

原核生物的染色体和质粒，真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子，从一个固定的起点开始复制，复制方向大多是双向的，形成两个复制叉。真核生物染色体DNA是线性双链分子含多个复制起点－多复制子真核生物染色体DNA是线性双链分子，有多复制起点，是多复制子大肠杆菌染色体DNA的复制起点oriC二）DNA复制的起点与方式大肠杆菌复制起点oriC245bp鼠伤寒沙门氏菌复制起点ori296bpDNA复制是指遗传信息从细胞的亲代向子代的传递过程。DNA分子是由两条互补链组成，复制时双链分开，然后以每条链为摸板，根据碱基配对原则，复制成两个同样的DNA，是一个十分复杂而精确的过程，涉及许多蛋白质因子和酶。细菌DNA的复制叉移动速度大约50000bp/min真核生物染色体DNA的复制叉移动速度较慢，大约为1000～3000bp/min三）有关DNA复制的酶重要酶：DNA聚合酶、解除DNA高级结构的酶等1.DNA聚合酶：（DNApolymerase）以脱氧核苷三磷酸（dNTP）为底物，催化合成DNA的一类酶。（不同生物有不同的种类）

A、原核细胞DNA聚合酶pol.Ⅰ（1956），需Mg2+orMn2+功能

1.催化聚合：以单链DNA为摸板，四种dNTP为底物，与摸板DNA互补的一段具有3‘OH末端的低聚脱氧核苷酸为引物，聚合反应方向5’→3‘，产物是与摸板互补的DNA链。合成速度约1000-1200dNTP/min2.校正功能：外切核酸酶,3’→5‘外切酶—错配核苷酸,5’→3‘外切酶—引物pol.Ⅱ(1969)功能

1.聚合;引物RNA，合成速度约2400dNTP/min2.外切酶;3’→5‘的外切酶活性,pol.Ⅲ1969功能1、聚合、引物RNA，速度约50000dNTP/min2、外切酶；3’→5‘的外切酶活性

5’→3‘的外切酶活性pol.Ⅲ是真正的DNA复制酶，在摸板DNA上从引物开始合成新链聚合由它催化。pol.Ⅰ的功能主要为修复功能，切除错配核苷酸及引物并填补引物去除后的空缺。pol.Ⅱ的功能可能是辅助pol.Ⅰ。DNApol.α、β、γ、δ、ε(多亚基）细胞核DNA复制,DNApol.αDNApol.δ↓↓校正功能引物合成核DNA合成（有3’→5‘外切酶活力）

DNA修复,DNApol.β,DNApol.ε

主要参与DNA修复线粒体DNA复制：DNApol.γB、真核细胞的DNA聚合酶2、DNA连接酶TACAGGAATGTCCTpppppp

5‘3‘DNA连接酶：（DNAligase）:催化形成不间断的3‘，5’-磷酸二酯键，是复制中的最后主要步骤——封闭新合成链上引物去除后留下的单链空缺。OHTACAGGAATGTCCTpppppp3‘5‘核酸的拓扑结构是指核酸分子的空间结构关系，是一种双螺旋核酸分子表现的曲线或曲面的空间关系。生物体内的DNA分子通常处于负超螺旋状态3、旋转酶与解旋酶—核酸的拓扑结构3、旋转酶与解旋酶—解除高级结构的酶DNA旋转酶（gyrase）——DNA拓扑异构酶拓扑异构酶Ⅰ：通过“切口-封口”（单链断裂）反应，就可使维持DNA超螺旋的作用力释放出来，从；而解除超螺旋，放松负超螺旋。旋转程度降低会出现负超螺旋拓扑异构酶Ⅱ：放松正超螺旋，反应需要ATP参加（双链可同时发生断裂）。旋转程度增加会出现正超螺旋解旋酶（helicase）作用解开DNA双螺旋→单链DNA解旋酶是借ATP水解提供的能量来解开DNA双链的，每解开一对碱基，需要水解2分子ATP解旋酶4．引发酶各种DNA复制开始时需要引物，在此基础上才能进行DNA聚合反应通常复制的引物——一小段RNA引发酶：催化RNA引物合成的RNA聚合酶，以ATP或GTP为能源引发体：引发酶还与DNA复制起始点双链的解开有关，常与解旋酶紧密连接，形成引发体，协调催化解旋和引发反应。5．单链结合蛋白

（Single-strandbindingProteinSSB）

与单链DNA结合的特异蛋白，保证单链区的稳定。解开的两条单链随即被SSB所覆盖。四）DNA的半不连续复制

新链一条连续,一条不连续合成

DNA聚合酶只能按5‘—3’方向催化合成DNA

不能催化3‘—5’方向合成,DNA复制时两条模板链上齐头并进合成新链是不可能的.先导链或前导链后续链或滞后链冈崎片段的长度:原核细胞1000-2000bp真核细胞100-200bp半不连续复制DNA复制沿复制叉向前移动时,两条亲代单链DNA都作为模板.对应3‘—5’模板链，新链的合成方向是5‘—3’.能连续合成,这条新链叫先导链或前导链。对应5‘—3’的模板链，合成方向与复制叉移动方向相反,且是在模板上先合成若干短的DNA片段—冈崎片段,然后在连接酶的作用下连成一条完整新链,这条链称后续链或滞后链。这种前导链的连续合成和后续链的不连续合成,称为DNA的半不连续复制.五）DNA的复制过程

起始-延伸-终止

1、起始—有固定的起点E.coli的复制起点为oriC,由245bp构成关键序列在于两组短的重复三个13bp的序列和四个9bp序列三个13bp序列四个9bp序列GATCTNTTNTTTTTTATCCACA五）DNA的复制过程

起始-延伸-终止

1、起始—有固定的起点①

识别起始位点DNA的合成是从模板的特定的位点开始。复制开始时,蛋白DnaA识别起始位点(有专一顺序,并富含A-T)。蛋白DnaB(又称解链酶)及引发酶协助识别并结合到模板的起始位点,开始引物的合成。1、起始—有固定的起点②DNA解链

旋转酶,解旋酶与复制起点结合,解开双螺旋形成两条局部单链,单链结合蛋白也随即结合到DNA单链上。③RNA引物的合成引发酶(RNA聚合酶)以DNA链为模板合成RNA引物主导链合成一个底物,后续链则结合多个引物酶,合成许多冈崎片段的引物。引物长度:原核生物,10-60bp

真核生物,2-10bp(哺乳动物)2、延伸—酶催化以高速度进行

在DNApol.Ⅲ(真核细胞pol.α)的催化下,以模板链3‘—5’的核苷酸顺序互补的原则,在RNA引物的3‘-OH末端逐个接上dNMP(每形成一个磷酸二酯键,释放一个PPi),直至合成整个前导链和冈崎片段.

延伸过程需延伸因子,ATP等物质参与延伸速度高,E-coli中可达50000bp/minDNA复制的起始点是固定的,严格的，但终止位点却不是很严格。大肠杆菌有六个终止子位点E.coli

terA-terF

①RNA引物的切除和缺口的填补

5‘端或冈崎片段5’端的引物由RNaseH或pol.Ⅰ(5’_3’外切酶活性)切除并填补②DNA片段的连接

最终由DNAligase

催化形成(空缺位的)磷酸二酯键,完成新链的合成.

新DNA分子还需在旋转酶作用下形成具有空间结构的DNA,实际上是在复制的过程中就螺旋空间化了。3、终止滚环复制—低等生物的非染色质DNA如plasmidDNA复制环状DNA双链复制时,一股链先打开缺口,5‘端向外伸展,在伸展出的单链上进行不连续复制,没有开环的另一股则一边滚动一边进行连续复制,开环与不开环的两股链均可直接作模板,合成两个环状的子双链.D-环复制线粒体及叶绿体复制DNApol.α、β、γ、δ、ε(多亚基）细胞核DNA复制,DNApol.αDNApol.δ↓↓校正功能引物合成核DNA合成（有3’→5‘外切酶活力）

DNA修复,DNApol.β,DNApol.ε

主要参与DNA修复线粒体DNA复制：DNApol.γ真核生物的DNA复制

DNA聚合酶真核生物染色体DNA是线性双链分子，有多复制起点，是多复制子真核生物染色体DNA的复制叉移动速度较慢，大约为1000～3000bp/min5F脱氧尿苷（5FU）能够抑制胸腺嘧啶核苷酸的合成，是DNA合成的强烈抑制剂，用于治疗癌症。真核生物的DNA复制

端粒端粒－真核生物线性染色体的两端具有许多串联的重复系列。通常一条链上富含G，其互补链上富含C。端粒的功能－稳定染色体末端结构，防止染色体间末端连接。人的端粒TTAGGG，四膜虫端粒TTGGGG端粒酶－逆转录酶；可外加重复单位到5’末端上，维持端粒的一定长度。二、DNA修复与DNA突变1、DNA的突变由于DNA碱基顺序的改变引起生物遗传性状显著变化的现象，称为基因“突变”。DNA受如下因素影响,电离辐射,氧自由基,化学致癌物,紫外线等影响会使DNA发生突变.

突变的方式:①二聚体(胸腺嘧啶),烷基化

单点突变,DNA序列上单个碱基的改变—碱基替换,多点突变，碱基顺序颠倒

③移码突变,DNA序列上碱基插入或缺失2、DNA修复DNA突变每天都会发生,但机体有强大的“修复队伍”五种修复系统

错配修复直接修复切除修复重组修复易错修复①错配修复（新链校正）2、DNA修复2、DNA修复DNA突变每天都会发生,但机体有强大的“修复队伍”E.coliDNA损伤的修复

②

直接修复方式光复活酶能识别损伤部位,并将二聚体切开自杀酶:将烷基转移到酶蛋白上→酶蛋白分解③切除修复方式一般损伤只发生在DNA双链中的一条上核酸内切酶切除损伤部位,以另一条DNA为摸板,polⅠ连接到切口,连接酶将切口封上.④重组修复方式上述切除修复过程发生在DNA复制之前，又称复制前修复遗传缺损的子代DNA可通过遗传重组来弥补，其修复发生在DNA复制之后，就称复制后修复重组修复机制缺陷，有可能导致癌症⑤应急反应（SOS）和易错修复许多能造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应。SOS反应能加强切除修复和重组修复SOS诱导产生聚合酶Ⅳ和Ⅴ,在一些DNA链的损伤部位能进行易错修复,即使出现不配对碱基,复制仍然进行,是生物在不利环境中求生存的功能.

Deinococcusradioduransgrowingonagarplatesinthepresenceof6000radsperhourofradiation.SideviewofDeinococcusradiodurans.Twocompartmentsarevisible,asisaDNAring,stainedblue.WeizmannInstituteimage

Deinococcusradiodurans(耐辐射球菌)是目前已知的抗辐射能力最强的微生物，其抗辐射能力达到1.5×106rads（人的致死剂量为500rads）。B.真核细胞DNA损伤的修复

真核细胞也有“自杀酶”，“核酸内切酶”癌症的发生，人类的老化是修复系统活力下降而容易引起突变有重要的联系。第20章、RNA的生物合成（转录）RNA的生物合成（转录）基因表达：遗传信息从DNA通过RNA传递到蛋白质称为基因表达。转录：遗传信息从DNA到RNA的转移。RNA生物合成转录：以DNA为模板的RNA合成复制：以RNA为模板的RNA合成（病毒，高等动物的特定组织）

一、RNA聚合酶RNA聚合酶：以双链DNA的一条为模板，四种NTP为底物，催化RNA合成的酶，其序列与DNA有意链一致。

RNA聚合酶

（NMP）n+NTP（NMP）n+1

+PPi

DNA,Mg2+(Mn2+)

1、原核细胞RNA聚合酶（polymerase）

—几种RNA基本由一种酶催化E．coliRNA聚合酶全酶由5个亚基组成α2ββ’σ(ω)E．coliRNA聚合酶核心酶α2ββ’（不含σ）σ—起始因子；主要功能识别起始位点并与DNA形成稳定的复合物，核心酶；催化各NTP（NMP）之间形成3‘-5‘-磷酸二酯键，使RNA延长。但不具有起始合成RNA的能力。2、真核细胞RNA聚合酶

—目前发现有三种Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ真核RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ存在于细胞核不同部位（核质，核仁），根据对α-鹅膏蕈碱（α-amanitinc）的敏感程度不同分类。真核细胞RNA聚合酶的种类和功能类型分布催化转录产物α-鹅膏蕈碱的敏感性

Ⅰ核仁45srRNA_rRNA前体不敏感

Ⅱ核质HnRNA(mRNA前体)敏感

Ⅲ核质tRNA5srRNA中等敏感二、基因转录的过程模板的识别，起始，延长，终止

合成方向5‘—3‘

与DNA复制不同处：不需引物以一条DNA—模板链（watson链）为模板(负链)

对应的链为编码链(正链),有意链天然（双链）DNA作为模板比变性（单链）DNA更有效。1.起始——启动子promoter是基因转录的起点①起始部位识别-35序列附近，具有TTGACA－识别区σ因子识别该部位RNA聚合酶在σ亚基引导下识别并结合到启动子上，DNA双链被局部解开，形成解链区的转录泡(transcriptionbubble).转录的第一个核苷酸常为三磷酸鸟苷或三磷酸腺苷σ识别部位结合部位RNA转录开始+1

（GTP，ATP)1.起始——启动子promoter是基因转录的起点

①起始部位识别

-35序列附近，具有TTGACA－识别区

σ因子识别该部位②RNApol.(全酶)promoter结合结合位点TATAAT（-10bp）——Pribnowbox

（富含A.T.DNA易解旋）③转录起始点酶-promoter-GTP(ATP)

（第一NTP）开始合成RNAσ识别部位结合部位RNA转录开始+1

（GTP，ATP)原核生物启动子上游控制元件转录起始新生RNA达6-9个核苷酸时，σ因子就下来。大肠杆菌的一般基因由因子所识别识别热休克应急蛋白基因的是因子所识别足迹法+DNA测序（启动子序列结构测定）先将DNA转录的限制片段分离出来，加RNA聚合酶使之结合，再用DNA酶水解，与酶结合的部位不水解，其它部位被水解成长短不同的片段，凝胶电泳后测出酶结合部位的基因序列。真核细胞转录的起始步骤比较复杂mRNA基因的启动子在

-25bp5’-TATAbox-Hognessbox-10bpGCbox-110bpCAATbox（上游元件）启动时还需起动增强子（enhancer）等多种因子(-25)真核生物的启动子有三类，真核生物的启动子由转录因子而不是RNA聚合酶所识别保守的起始子2、延长随着核心酶在模板DNA上滑行，使模板DNA不断旋转，RNA链由5‘-3’方向延长，E.coli37ºC的转录速度为20-50bp/s同时又可有另一RNApol全酶结合到promoter上，开始新的转录，且DNA-RNA杂交链氢键不牢固，易分开。3．终止—RNA链延伸停止，新生RNA链从三元复合物（DNA-酶-RNA）中释放出来1>不依赖蛋白质因子(ρ)的终止DNA模板有终止信号合成的mRNA3/末端富含G-C（回形结构）并带有一段寡聚U寡聚U可能提供信号使聚合酶脱离模板2>依赖ρ因子的转录终止

在终止部位，ρ因子沿新生RNA链到达依赖ρ的终止点（无寡聚U和GC区），ρ因子与RNA聚合酶结合，使三元复合体解体.3>真核细胞的终止（尚未阐明）基因末端合成一段AAUAAA顺序后，再前进一段并停止，修饰时在AAUAAA顺序后切断并加一段约200核苷酸的polyA.1．不对称转录—DNA一条链作模板不对称转录：DNA链中常常只有一条DNA为模板，转录生成RNA.这条DNA链为负(-)链，转录链，模板链，反意链，Watson链.另一DNA为正(+)链，信息链（编码链），有意链

Crick链.不同基因的信息链并不全在同一链上,顺反子

三．基因转录的方式2．反向转录—以RNA作为模板合成DNA逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶，）模板:RNA,合成方向5‘-3’,底物:四种dNTP是病毒（RNA病毒）基因转变为宿主细胞DNA的基因的感染转化过程，癌病毒基因在宿主细胞中形成的机理。逆转录酶是一种多功能酶以RNA为模板合成互补的DNA链，形成RNA－DNA的杂合分子。具有RnaseH样的活力，水解RNA－DNA的杂合分子中的RNA。以新合成的单链DNA为模板，合成互补链，形成双链DNA分子。致癌RNA病毒HIV病毒(一）原核生物RNA前体的加工①原核生物rRNA前体的加工；甲基化修饰，核酸内切酶及核酸外切酶的切割四．转录产物的加工修饰(一）原核生物RNA前体的加工

②原核生物tRNA前体的加工；

核酸内切酶及核酸外切酶的切割,

3’端的修剪，再接上CCA-OH

核苷酸的修饰和异构化真核生物的tRNA基因的数目比原核生物tRNA基因的数目要大得多。真核生物的tRNA的基因也是成簇排列(一）原核生物RNA前体的加工

③原核生物mRNA的加工；

大多原核生物mRNA不需要加工

少数多顺反子mRNA需通过核酸内切酶切成较小的单位,然后再翻译。

四．转录产物的加工修饰1．转录产物特点——先合成前体

初产物：一般不是生物学功能的RNA前体,需经加工和修饰后，才成为成熟RNA(mRNA,tRNA,rRNA)真核细胞mRNA是核内不均一RNA-hnRNA（heterogeneousunclearRNA,hnRNA）转变而来的，大约只有10%hnRNA可转变成mRNA(二）真核生物RNA前体的加工卵清蛋白3．加工方式①加帽mRNA（真核）第一个核苷酸去一个磷酸，加一个GMP5’-5↑

N7甲基化

帽子结构mGpppN-RNA

避免5’端受核酸内切酶的降解2．加工修饰的共性—切除部分核苷酸链加帽②加尾真核mRNA的3‘端有一个polyA

150-200base与稳定性与翻译效果相关③剪接真核

由RNA酶完成，剪去内含子部分

同样的原始转录产物通过不同的剪切方式可产生不同的mRNA，并因而翻译出不同的蛋白质。其不同之处只是有些蛋白质含有全部结构域，有些蛋白质缺少一部分结构域。甲状腺降钙素降钙素基因相关肽④修饰：rRNA和tRNA在成熟过程中都发生碱基或核糖的甲基化等细胞基因的表达，DNA-RNA-protein,是受到严格的调节控制的。在细胞的生长、发育和分化的过程中，存在时序调控与适应调控。主要通过转录水平的调控来实现。Jacob和Monod于1961年提出操纵子结构模型，较好地说明了原核微生物基因表达的调节机理。五．基因转录的调节操纵子-operon操纵子基因表达的协调单位.具有共同控制区和调节系统。每个操纵子-operon中含有启动子－promoter，实行严格的启动调控.操纵子包括在功能上彼此相关的结构基因和控制基因

启动子是转录调控的控制部位，转录调节因子的结合位点存在于启动子的内部或启动子的附近。启动基因Ppromoter—启动子转录时与RNA聚合酶首先结合区域五．基因转录的调节A．原核细胞基因表达的模型—操纵子学说

操纵子Operon—基因表达的协调单位（包括功能上彼此相关的结构基因和控制基因）结构基因S：决定蛋白质结构的基因启动基因Ppromoter—启动子：转录时与RNA聚合酶首先结合区域操纵基因OOperater—操纵区：与调节基因产生的一种特异蛋白结合的区域终止