疾病分子基础理论

疾病分子基础理论生物信息学主要研究领域⑴建立和管理各种生物信息数据库①核酸序列数据库②三维结构数据库⑵基因组序列信息的提取和分析①序列比对（Alignment）和结构比对②蛋白质结构预测③蛋白质编码基因的计算机辅助识别④非编码区分析和DNA语言研究⑤分子进化和比较基因组学、遗传密码的起源⑥序列重叠群（Contigs）的装配⑶生物大分子结构模拟及其与疾病、药物设计⑷DNA芯片和微阵列的发展疾病分子基础理论建立和管理各种生物信息数据库各种生物数据库的建立是一切生物信息学工作的基础。数据库是生物信息学的主要内容，各种数据库几乎覆盖了生命科学的各个领域。如EBI的SRS(SequenceRetrievalSystem)包含了核酸序列库、蛋白质序列库，三维结构库等30多个数据库及CLUSTALW、PROSITESEARCH等强有力的搜索工具，用户可以进行多个数据库的多种查询。疾病分子基础理论生物信息数据库核酸序列数据库Genbank，美国国家生物技术信息中心的数据库（://）。

EMBL，建立在欧洲分子生物实验室的数据库()。DDBJ，日本的DNA数据库银行（://)。与基因组有关的数据库还有ESTdb,GDB,GSDBOMIM(/)，EBI的SRS（sequenceretrievalsystem）使用户可以进行多个数据库的多种查询。疾病分子基础理论蛋白质序列数据库有SWISS-PROT:///,PIR,OWL,NRL3D,TrEMBL等蛋白质片段数据库有PROSITE/,BLOCKS,PRINTS等SCOP:///,CATH,FSSP,3D-ALI,DSSP等疾病分子基础理论与疾病的关系研究

基因多态性分析即使一个基因的序列已经确定，它只是有代表性的序列之一，在群体分布中，仍存在有基因的多态性。正是由于多态性的存在，生物表型及对环境、外源物和药物的反应即不同。研究基因多态性可以对群体的基因共性及其中的基因个性(SNPs)都有明确的认识。

基于遗传的流行病学研究流行病学研究是医学信息学的重要课题之一。将流行病学的遗传和非遗传性的研究与分子基因信息结合起来，会导致对疾病的机理、个体对某种疾病的易感性和疾病在群体中的分布有更明确的认识，对疾病的预防和治疗有极大的指导意义。

疾病分子基础理论基因结构与表达异常与疾病细胞微环境的变化，包括基因甲基化的变异以及各种特定基因表达的异常都和疾病发生有关。越来越多的证据显示基因表达的异常将导致各种疾病的发生，尤其是肿瘤形成。疾病分子基础理论基因结构与表达异常与疾病发生

1．基因结构改变

2．细胞间信号异常3．

细胞内因素疾病分子基础理论基因突变的多种类型

点突变是单个碱基的改变缺失是一个或多个核苷酸的丢失插入是一个或多个核苷酸的增加倒位是一段核苷酸序列方向倒转基因突变还分为配子突变与体细胞突变动态突变指串联重复拷贝数随世代的传递而改变疾病分子基础理论基因突变由于体内外各种因素改变了某基因特定的DNA序列碱基组成和排列顺序，导致DNA一级结构发生改变，改变了基因结构；其分子机制可以是替换、插入或缺失，因而产生不同的突变类型。疾病分子基础理论基因突变的类型

点突变:单个碱基的改变在基因一级结构的某个位点上，一种碱基被另一种碱基取代。

分为：转换（transition）颠换（transversion）疾病分子基础理论基因突变的类型

缺失（deletion）是一个或多个核苷酸的丢失：在基因一级结构中某个位点上，一个核苷酸或一段核苷酸序列丢失造成的基因结构改变。

3.插入（insertion）疾病分子基础理论基因突变的类型

倒位是一段核苷酸序列方向倒转：基因内部的DNA序列重组，使一段DNA序列的方向倒转。配子突变与体细胞突变动态突变指串联重复拷贝数随世代的传递而改变（dynamicmutation）疾病分子基础理论碱基置换突变(substitutionmutation)不同的基因突变引起不同的遗传效应a.同义突变(consensemutation)b.错义突变(missensemutation)c.无义突变(nonsensemutation)d.终止密码子突变或延长突变e.起始密码子突变(initiationcodonmutation)非编码序列点突变(pointmutationinnoncodingsequence)疾病分子基础理论结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病1.血红蛋白病(hemoglobinopathy)：血红蛋白(hemoglobin,Hb)的结构特点珠蛋白(globin)基因的时、空特异性表达疾病分子基础理论血红蛋白结构血红蛋白是由4条肽链（两个α和两个β链）组成的。每条肽链都类似于肌红蛋白的肽链，都结合一个血红素。血红蛋白的脱氧（T）和氧合（R）构象在氧的亲和性方面有很大区别。由于结构上的相互作用是与它的三级和四级结构有关，所以血红蛋白在结合氧的过程中显示出别构效应和协同性。疾病分子基础理论血红蛋白分子一级结构上的轻微差别就可能导致功能上的很大不同，正常成年人血红蛋白中的β链的第六位的谷氨酸残基被缬氨酸取代就会导致镰刀形细胞贫血病的异常血红蛋白HbS的生成。疾病分子基础理论血红蛋白病——镰刀形细胞贫血症疾病分子基础理论血红蛋白病类型异常血红蛋白:珠蛋白结构(质)变异，导致贫血。

地中海贫血:珠蛋白合成(量)减少，又称珠蛋白合成障碍性贫血。

疾病分子基础理论

(四)常见单基因病：疾病名称发病频率(‰)遗传方式致病基因典型症状血友病A0.1X连锁凝血因子Ⅷ不规则出血血友病B0.03X连锁凝血因子Ⅸ不规则出血杜氏肌营养不良0.3X连锁肌营养因子肌萎缩贝氏肌营养不良0.05X连锁肌营养因子肌萎缩脆性X综合征0.5X连锁FMR1智力障碍舞蹈病0.5常染色体显性舞蹈病因子痴呆神经纤维0.4常染色体显性NF-1,2癌变珠蛋白生成障碍性贫血0.05常染色体隐性珠蛋白基因簇贫血镰刀细胞贫血0.1常染色体隐性β珠蛋白基因贫血,局部缺血苯丙酮酸尿0.1常染色体隐性苯丙氨酸羟基化酶无苯丙酮酸代谢能力囊性纤维化0.4常染色体隐性CFTR进行性肺损伤及其他

疾病分子基础理论基因突变类型异常Hb氨基酸变化临床特征

错义突变

HbShuangfengα27Glu→Lys(GAG→AAG)不稳定Hb病

HbSβ6Glu→Val(GAG→GUG)镰刀型细胞贫血HbBibbaα136Leu→Pro(CUG→CCA不稳定Hb病

无义突变

HbMckeesRocksβ145Tyr→终止(UAU→UAA)不稳定Hb病

终止密码突变

HbConstantSpringα142UAA→CAAα-地贫(延长：142Gln173UAA)

密码子缺失

HbGunHillβ91～95缺失不稳定Hb病

密码子插入

HbGradyα118与119间插入3个氨基酸无明显症状

移码突变

HbTakβ147UAA→ACUAA不稳定Hb病158UAA(Thr)

融合突变

HbLepore-Bostonδ87(Gln)-β116(His)β-地贫HbKenyaγ81(Leu)-β86(Ala)β-地贫疾病分子基础理论囊性纤维化病(cysticfibrosis,CF)疾病分子基础理论囊性纤维化病

囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTCR)的基因突变所致，产生缺陷型蛋白，致使使氯离子的转运障碍，黏液在呼吸道黏膜内淤滞，黏膜形成囊性增生，造成呼吸道堵塞；因反复感染，导致患者呼吸衰竭而死亡。疾病分子基础理论GenetherapyofCF将重组CFTCR基因cDNA-病毒载体，用涂布鼻腔、或喷雾吸入气管及肺部等方法，转入患者呼吸道上皮细胞中，获得正常CFTCR基因的表达，纠正Cl＋转运缺陷，减少黏液分泌。疾病分子基础理论细胞间信号异常导致基因表达异常引起疾病人体各细胞间通过激素、神经递质、旁分泌信号等保持细胞间的联系，调节彼此的代谢。基因表达也受到细胞间信号的调控。AFP接受异常的细胞增殖信号成为肝癌发生的重要因素。粉尘刺激→肺支气管上皮、肺泡巨噬细胞→分泌TGF-β1→成纤维细胞→促细胞分裂和ECM蛋白基因表达→ECM增加→矽肺发生疾病分子基础理论（六）细胞内因素导致基因表达异常引起疾病异常的细胞内信号

高血糖→DAG↑→⊕PKC→⊕ACE→AngⅡ↑

病原生物基因的体内表达

异常的DNA甲基化hCG5'转录起始区低甲基化→非滋养层细胞hCG↑→受体结合→⊕cAMP→Tumor↑疾病分子基础理论基因结构和表达与疾病的研究策略1．通过结构分析确定基因变异

核糖核酸酶切分析、杂合双链分析、化学切割错配、酶促切割错配3．通过功能学研究确定致病基因转基因技术、基因敲除、反义技术、基因诱导超表达2．基因表达水平分析差异显示、抑制消减杂交、基因表达系列分析疾病分子基础理论核糖核酸酶切分析基本原理:在一定条件下，异源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中错配碱基可被核糖核酸酶RNase识别并切割，通过凝胶电泳分析酶切片段的大小，即可确定错配的位置。疾病分子基础理论核糖核酸酶切分析（RNasecleavage）缺点：当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，核糖核酸酶切割效率低甚至不切割；分析DNA的一条链，突变检出率为30%；同时分析DNA的两条链，突变检出率为70%；需要制备特异性的RNA探针疾病分子基础理论杂合双链分析法

（heteroduplexanalgsis,HA）

直接在非变性凝胶上分离杂交的突变型-野生型DNA双链。由于突变型和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成单链环形突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应同源双链DNA不同的迁移率。疾病分子基础理论化学切割错配法

（Chemicalcleavageofmismatch,CCM）

基本原理：将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或RNA片段混合变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C能被羟胺和哌啶切割，错配的T能被四氧化锇切割，经变性凝胶电泳可确定是否存在突变。疾病分子基础理论差异显示技术(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionchainreaction,DDRT-PCR)在不同的生长时期、在个体的发育与分化的不同阶段、在生物体对疾病的反应以及不同的环境下调控基因的表达是不同的，这就是基因的差别表达（differentialexpression）。疾病分子基础理论抑制性差减杂交

(suppressivesubtractivehybridization,SSH)原理SSH是差减杂交与PCR结合的快速分离差异基因的方法。运用杂交动力学原理，丰度高的单链DNA退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，使不同丰度的单链DNA得到均衡；抑制PCR利用链内退火优于链间退火的优点，使非目的基因片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构,无法作为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增，从而使目的基因得到富集、分离。疾病分子基础理论方法提取实验组和对照组mRNA合成双链cDNA，经识别4碱基的限制性内切酶切割实验组cDNA平均分为2份，分别连接2个接头进行2轮差减杂交和抑制性PCR获得富集的目的基因疾病分子基础理论抑制性差减杂交

(SSH)

流程图疾病分子基础理论

检测组(Tester)—含目的基因cDNA，加接头驱逐组(Driver)—不含目的基因cDNA，不加接头*接头含PCR引物正向SSH:易感者(Tester)+

不易感者(Driver)易感者特异表达或高表达基因反向SSH:不易感者(Tester)+

易感者(Driver)不易感者特异表达或高表达基因

抑制性差减杂交(SSH)

疾病分子基础理论优点采用两次差减杂交和PCR，保证了高特异性(假阳性率可降至6％);在杂交过程中可使不同丰度基因均衡化，获得低丰度差异表达基因;操作相对简便，是目前分离新基因的主要方法缺点起始材料需要g级量mRNA;SSH差减克隆片段较小，获取cDNA全长序列有一定难度

抑制性差减杂交(SSH)疾病分子基础理论ElkelesA,etal.MolCellBiol1999;19:2594-2600

Thec-fosproto-oncogeneisatargetfortransactivationbythep53tumorsuppressor

采用SSH法证实,在p53介导的细胞凋亡过程中，c-fos是p53转录刺激的靶基因,从而提供了这两种重要调控蛋白相互作用的直接依据抑制性差减杂交(SSH)疾病分子基础理论KosticCandShawPH.Oncogene2000;19:3978-3987Isolationandcharacterizationofsixteennovelp53responsegenes

通过SSH比较了p53缺失和含p53的结肠癌细胞株间基因差异表达，发现16个p53依赖的下游靶基因

抑制性差减杂交(SSH)疾病分子基础理论基因表达系列分析

(SerialAnalysisofGeneExpression,SAGE)

是一种用于定量、高通量基因表达分析的实验方法(Velculescuetal.,1995)。SAGE原理:分离每个转录本的特定位置的较短的单一的序列标签（约9-14个碱基对），这些短的序列被连接、克隆和测序，特定的序列标签的出现次数就反应了对应基因的表达丰度。疾病分子基础理论Serialanalysisofgeneexpression(SAGE)技术流程反转录酶切连接测序单条测序＝＝对30－40条EST测序分析由于采样量大大提高，可对低表达基因进行分析：基因表达量分析、寻找新基因等等实验步骤较长要求较高疾病分子基础理论转基因技术

指在生物基因组中带有插入或整合入的外源基因，生物个体能将它一传给后代，并表达出该基因的生物活性物质，从而使受体生物获得新的性状。疾病分子基础理论RetroviralMediatedGeneTransferMoMuLVProducingCellsMouseembryosInsertionofviralDNAcontainingtransgeneintoembryosTransgenicMouse疾病分子基础理论核酶技术确定基因在疾病中的作用1.RNA分子，催化核糖体RNA中内含子的自我拼接；除了催化RNA的剪切，还可催化DNA的剪切、RNA的聚合、RNA链的复制等。2.优点:其底物的碱基配对特异性。核酶与底物结合常形成“发夹”结构或“锤头”结构。3.设计核酶特异性地结合于靶点，以其本身酶活性进行剪切。疾病分子基础理论三、疾病相关基因的功能克隆和定位克隆1．疾病相关基因2．功能克隆3．定位克隆疾病分子基础理论疾病相关基因与疾病单基因病(一个基因位点上的缺陷)多基因病(涉及两个以上的基因位点)染色体病(染色体结构与数目的改变)获得性基因病(遗传易感性或病原微生物)疾病分子基础理论功能克隆(Functionalcloning)

以获得的蛋白质表达及功能信息为线索，分离鉴定出相应的基因，叫未知基因的功能克隆。疾病分子基础理论

基因克隆（genecloning)功能克隆（functionalcloning）根据特异蛋白质分离目的基因的策略表型克隆（

phenotypecloning）根据特异mRNA分离目的基因的策略

疾病分子基础理论

功能克隆氨基酸序列核苷酸序列PCR特异蛋白质目的基因抗体基因文库筛选评价优点--在单基因性状的基因分离方面仍为常用策略缺点--特异蛋白质确定、鉴定及其纯化困难*--难以分离微量表达基因--无法研究无蛋白质产物的基因--难以进行多基因控制性状的基因分离疾病分子基础理论定位克隆又称为“逆向遗传学”，始于20世纪80年代后期利用遗传连锁或细胞学定位技术将致病基因定位于染色体的特定区带。定位：通过连锁分析找出与目的基因紧密连锁的遗传标记在染色体上的位置。克隆：从定位的染色体区段内分离克隆所要的基因，并进一步研究其功能。疾病遗传标记，染色体定位基因序列mRNAcDNA蛋白质产物生物学功能疾病

基因功能疾病分子基础理论定位克隆：通过遗传标记，先获得某一表型基因在染色体上的定位，再在候选区域内选择已知基因，进行致病突变的筛选，并获得cDNA及全基因。

基本思路是通过连锁分析原理进行基因定位。

若多态标记与待定基因距离较远，则它们在向子代传递时会发生自由分离，呈“连锁平衡”；反之，则不发生自由分离，而呈现“共分离”现象，即“连锁不平衡”。据此可在染色体上定位与某一DNA标记相连锁的基因。疾病分子基础理论定位候选克隆该方法是定位克隆的进一步发展将疾病相关基因定位于染色体相关区域该染色体区域得到若干候选基因进一步分析得到目的cDNA蛋白质功能研究疾病染色体定位若干候选基因确定目的基因蛋白质功能疾病分子基础理论将基因定位于染色体特定区段2.候选基因筛选鉴定疾病分子基础理论

定位克隆的主要步骤之一是将目标基因定位于特定染色体上。

主要方法：

家系遗传调查分析法、染色体断裂点分析（家系选择、分离分析、连锁分析）

体细胞杂交法

核酸杂交技术突变分析技术

疾病分子基础理论家系遗传分析法选择一个含有40多个能提供信息的减数分裂事件的三代以上的家系，要排除家系的异质性；除了对照基本遗传表型的各种表现型的几率外，还要考虑外显不全；以数学计算机模型模拟分析；选择一定的遗传标记，进行基因分型，确定疾病基因在染色体上的位置。疾病分子基础理论基因连锁分析连锁分析主要是应用限制酶片段长度多态性（RFLP）为遗传标志进行家系分析在人类基因组中，平均约200bp可发生一对变异（称为中心突变）中心突变造成了序列上的多态性，不少序列多态性发生在限制酶识别位点上，产生了限制酶酶切位点的多态性用该限制酶水解DNA就会产生长度不同的片段，称RFLP。疾病分子基