仪器分析课件 色谱分析(液相)

高效液相色谱分析HighPerformenceLiquidChromatographyHPLC气相色谱法适用于分析相对分子质量较小、沸点较低、热稳定性好的物质，这些物质仅占有机化合物总数的25%～30%。对于热稳定性差、相对分子质量大(400以上)(如生化试样)、沸点高的物质，占有机物总量的75%-80%。宜用高效液相色谱法进行分析。高效液相色谱法是用液体作为流动相的色谱法。现代高效液相色谱经典液相色谱经典液相色谱与高效液相色谱的异同H=A+Cu

现代高效液相色谱法具有下列特点：(1)高压：液相色谱法使用液体作为流动相(简称载液)，液体流过色谱柱时，所遇到的阻力很大，为了使载液迅速通过色谱柱，必须对载液施加高压。高效液相色谱法工作压力高达20MPa～30MPa。(2)高速：高效液相色谱法的分析时间较经典的液相色谱所需的时间要少得多，分离一个样品只需几分钟至几十分钟，仅为经典液相色谱的几十分之一。(3)高效：一般气相色谱法的色谱往是数千塔板／米，高效液相色谱法的塔板数可达约3万塔板/米，使分离效率大大提高。(4)高灵敏度：紫外光度检测器的检测限可达10－9g，荧光检测器的灵敏度可达10－11g。(电化学检测器,蒸发光散射检测器)五个部分：高压输液系统、进样系统、色谱柱、检测系统、记录仪。（一）高效液相色谱仪离子色谱的基本流程图

1.高压输液系统高压输液系统由贮液器、高压泵、梯度淋洗装置组成，核心部分是高压泵。

高效液相色谱的流动相应满足如列要求：

(1)应具有足够的纯度，一般选用色谱纯试剂。

(2)流动相与固定液应互不相溶。

(3)流动相对试样各组分应有适当的溶解度。

(4)粘度小。()(5)检测器对流动相不产生响应。①高压泵

高效液相色谱仪的重要组成部分，应具备如下性能:（1）有足够的输出压力，使流动相能顺利地通过颗粒很细的色谱柱，通常在14.7MPa～44MPa之间；（2）输出流量恒定无脉动，其流量精度在1%～2%之间；（3）输出流动相的流量范围广且流速可调，对分析仪器，一般为3mL/min；制备仪器为10～20mL/min。②梯度淋洗装置应用梯度淋洗，可以提高分离效果。梯度洗提法：在分离的过程中，应用梯度淋洗装置，按一定的程序改变两种或两种以上不同极性的溶剂之间的比例，使流动相的成分和极性产生相应的变化，从而改变复杂物质中不同极性的组分的相对保留值，提高分离效果，加快分析速度。2.进样装置①注射器进样装置优点：可以任意改变进样体积，注射快速，不易造成峰扩张缺点：重现性较差，试液容易渗漏

②高压定量进样阀(六通阀)

由阀芯、阀体、定量管组成。优点：进样量的可变范围大，耐高压，易于自动化缺点：容易造成色谱峰扩张开始分析废液样品

淋洗液至分离柱进样阀样品装样废液

淋洗液至分离柱六通阀定量环进样（ＬＯＡＤ）（ＩＮＪＥＣＴ）样品环3.色谱柱常用内壁抛光过的不锈钢管制成标准柱型：内径为4.6mm或3.9mm，长为15cm～30cm的直形不锈钢柱。发展趋势是减小填料粒度和采用化学键合固定相以提高柱效。4.检测器应具有：灵敏度高、噪音低、线性范围宽、定量准确、适应范围广等特点，同时还应该对温度和载液流速的变化不敏感。可用的检测器有：紫外、折光、电导、荧光、电化学检测器等常用的检测器有：紫外-可见光度检测器和差示折光检测器①紫外-可见光度检测器(传统的)一种小型的装有流动池的双光束光度计紫外-可见光度检测器灵敏度很高，检测限可达10-9g·mL-1优点：这种检测器对温度和流速不敏感，适宜于梯度淋洗缺点：不能用于对紫外-可见光完全不吸收的试样的检测光电二极管阵列检测器示意图Diode-ArrayAbsorptionSpectraoftheeluentfromamixtureofthreesteroidstakenat5-secondintervals②差示折光检测器

(无紫外吸收的可测)

一种浓度型检测器，是通过连续测定测量池中溶液折射率的变化来测定组分的浓度。优点：凡与流动相折射率不同的组分，都可以用差示折光检测器来检测，所以差示折光检测器是一种通用型检测器。差示折光检测器的灵敏度可达10-7g·mL-1(灵敏度比紫外低)缺点：对温度和流速的波动很敏感,灵敏度低.

DifferentialRefractive-IndexDetector

(示差折光检测器）

FluorescenceDetector

荧光检测器ElectrochemicalDetector

电化学检测器ConductivityDetector

电导检测器—离子色谱检测器新的HPLC检测器Pulsedamperometricdetection(PAD)-----脉冲安培电化学检测Evaporativelight-scatteringdetection(ELSD)-----蒸发光散射检测（通用型）PerformancesofHPLCDetectors（二）高效液相色谱法中影响分离的因素及操作条件的选择

塔板理论:

速率理论：H=A+C·u

*选择颗粒较小的均匀填料

*采用化学键合固定相*采用粘度小的流动相*降低流速流动相流速及填料粒径对柱效的影响

Effectofmobilephasevelocityofthecolumnefficiency

在HPLC中，是否可以通过降低u有效提高柱效？液-固色谱法液—液色谱法离子交换色谱法凝胶色谱法（三）高效液相色谱法的分类及其分离原理流动相LIQUID

Liquid-LiquidChromatography

(Partition)

Liquid-SolidChromatography

(Adsorption)LiquidSolidNormal

PhaseReversePhaseNormalPhaseReversePhaseMobile

Phase-

NonpolarStationaryphase-

PolarMobilePhase-

PolarStationaryphase-

Nonpolar分离模式固定相TypesofLiquidChromatography对流动相的基本要求：流动相与固定相互不相溶试样要能够溶于流动相中流动相粘度较小流动相不能影响试样的检测常用的流动相：水、乙腈、甲醇、乙酸乙酯、乙醚、甲苯、正己烷、环己烷等。在各类LC中，流动相分子（离子）与组分分子（离子）共同竞争固定相

!!流动相条件的选择很重要!1.液-固色谱法（液-固吸附色谱法）

固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。LiquidSolidChromatography

(LSC)

Si-O-Hd-d+

SilicaGel30μmSi-OHHexaneOHC-CH3CH3CH3-CCH3CH3OHOHCH3CH3应用:常用于分离非极性、弱极性化合物，含有不同类型或不同数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同异构体。吸附重点要考虑洗脱！！①液-液色谱法的作用机制(分配色谱)

溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快。

液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。2.液-液色谱法（液-液分配色谱法）

将液体固定液涂渍在担体上作为固定相固定液NormalPhaseLLCReversePhaseLLC

NCCH3CH2OCH2CH2CN(Normal)CH3(CH2)16CH3

(Reverse)LiquidLiquidChromatography

(LLC)

重点要考虑保留！！②正相色谱和反相色谱★★★正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂(如苯、正己烷等)作流动相；★★★反相分配色谱用非极性物质作固定相(C18烷,ODS)

，极性溶剂(如水、甲醇、乙腈等)作流动相；★★★正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性，而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性。正相色谱适宜于分离极性化合物，反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性化合物。非极性的十八烷(ODS)化学键合固定相在硅胶表面利用硅烷化反应：流动相

TBAOH／ACN／H2O样品Y+X-

Ｈ２Ｏ

Ｈ２Ｏ固定相

TBA+OH-

Y+X-

Y+X-

(TBA+X-)

(TBA+X-)

(TBA+X-)

(TBA+X-)

TBA+OH-

ACN

ACN

ACN

ACN

ACN

ACN

ACN

TBA+OH-

TBA+OH-

疏水相

亲水相反相离子对HPLC分离机理

Y+

OH-离子对试剂：TBAOH（氢氧化四丁铵）

化学键合固定相优点：化学键合固定相无液坑，液层薄，传质速度快，无固定液的流失固定液上可以结合不同的官能团，改善分离效能固定液不会溶于流动相，有利于进行梯度淋洗③液-液色谱法的应用(固定液选择范围广)液-液色谱法既能分离极性化合物，又能分离非极性化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、稠环、染料、留族等化合物。化合物中取代基的数目或性质不同，或化合物的相对分子质量不同，均可以用液-液色谱进行分离。3.Ion-ExchangeChromatography(IEC)

SO3-Na+样品中的各组分离子竞争固定相（离子交换树脂）活性位点!（静电作用）Ion-ExchangeChromatographyofAminoAcidsGel-PermeationChromatography(GPC)

orSizeExclusionChromatography(SEC)

gelparticlebufferproteinmoleculesaltions4.凝胶渗透(排阻)色谱靠固定相的孔径分离不同分子质量（尺寸）的物质！（四）色谱分离方法的选择

1.气相、高效液相色谱法的应用范围★气相色谱法适用于分析相对分子质量较小，容易挥发成气体的物质。★气相色谱法控制温度可达300℃，热稳定性差的物质在此温度下将发生分解，但高沸点物质在此温度下也不能完全汽化。★高沸点、热稳定性差的有机化合物、以及相对分子质量大(大于400)的有机物(约占有机物总数的70%～80%)，均不宜应用气相色谱法进行分析，但可以应用高效液相色谱法进行分析。★高效液相色谱法在常温下进行分离与分析，不会导致被测物质的热分解，其流动相是液体，所以只要试样能制备成溶液，原则上都可以用高效液相色谱法分离与分析，如离子型化合物、不稳定天然产物以及氨基酸、蛋白质等高分子化合物均可用高效液相色谱法获得较好的分离效果。

2.色谱分离方法的选择选择的基本依据（1）相对分子质量的大小：★对于相对分子质量在200以下、易挥发、热稳定性好的化合物，可采用气相色谱法；★★相对分子质量在200～2000的化合物，可用液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法等液相色谱法。★★★相对分子质量大于2000的试样，适宜用凝胶色谱法进行分离。（2）试样的溶解性★能迅速溶于水或甲醇等极性溶剂的样品，可采用反相液-液色谱法；★★若试样全部或大部分能溶于HCl或NaOH溶液，表示试样属于离子型化合物，可采用离子交换色谱法来分离；★★★溶于非水溶性溶剂(如己烷、异辛烷、苯、甲苯等烃类)的试样，选用常规的液-液色谱(正相色谱)法和吸附色谱法；ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＨＣＯ３－Ｃｌ－ＳＯ４２－Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Temporalcourse离子交换分离机理ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＨＣＯ３－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

ＳＯ３－ＳＯ３－ＳＯ３－ＳＯ３－Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３阴离子交换树脂(乳胶型）５μm＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋