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文档简介
桂枝汤对脾虚大鼠NFATmRNA,IL4mRNA,IFNγmRNA的干预作用【摘要】目的:采用RTPCR方法来探讨桂枝汤对脾虚NFATmRNA,IL4mRNA,IFNγmRNA的影响以及干预Th1/Th2细胞漂移的机制.方法:40只大鼠随机分为空白对照组(A组)、脾虚组(B组)、桂枝汤大剂量组(C组)和桂枝汤小剂量组(D组)等4组,每组10只;用规范的脾气虚证大鼠模型造模方法将B,C和D组大鼠造模,B,C和D组分别用蒸馏水、桂枝汤大剂量、桂枝汤小剂量灌胃,标本采集后用RTPCR检测NFATmRNA,IL4mRNA和IFNγmRNA表达水平.结果:脾虚组的NFATmRNA,IL4mRNA表达上调;而IFNγmRNA表达下调,经桂枝汤大、小剂量组治疗后,NFATmRNA,IL4mRNA表达下调,IFNγmRNA表达上调.结论:桂枝汤对Th1/Th2细胞漂移作用途径可能是通过下调NFATmRNA的表达,恢复了IFNγmRNA正常转录水平,进而下调IL4mRNA的表达,使脾虚大鼠Th1/Th2细胞达到一种新的平衡.
【关键词】桂枝汤;活化T细胞核因子;白细胞介素4;γ干扰素
0引言
表明,在生理条件下,Th1细胞和Th2细胞分泌的两类因子互相调整,相互制约,处于一种动态平衡状态.一旦两者平衡失调,细胞因子作用于细胞表面相应受体,活化信号转导因子(signaltransducerfactor,STF),将刺激信号传至核内而发挥其基因转录的调节作用,使机体局部乃至全身发生病理反应[1].我们通过观察脾虚证模型动物Th1细胞、Th2细胞中具有代表性的γ干扰素(interferonγ,IFNγ)、白介素4(interleuin4,IL4)以及T细胞核因子(nuclearfactorofactivatedTcells,NFAT)mRNA的表达以及桂枝汤对三者的影响,探讨脾虚证模型动物与Th1/Th2细胞漂移的关系以及桂枝汤对其的逆转作用.
1材料和方法
材料SD大鼠40只,清洁级,雄性,体质量200~300g,由上海实验动物中心提供.在江西中医学院动物实验中心清结级25~27℃条件下饲养.SD大鼠在动物房适应性饲养1wk后,称质量并随机分为空白对照组,脾虚模型组,桂枝汤大剂量组,桂枝汤小剂量组,每组10只.桂枝汤中桂枝、白芍、甘草、生姜、大枣购于江西中医学院附属医院,按《伤寒论》原方10∶10∶7∶10∶10配比混合药物(大枣剖开)置于烧杯中.加入5倍蒸馏水冷浸60min,快速加热至沸腾,而后保持微沸状态15min,趁热抽滤,药渣中加入3倍蒸馏水,浸泡30min,快速加热至沸,微沸10min,趁热抽滤,弃药渣,合并滤液,水浴浓缩相当于生药1kg/L的滤液,4℃保存.主要试剂与仪器有卵清蛋白、刀豆蛋白A,Trizol(GibcoBRL公司),Rmasin,MMLV,Tag酶,并由上海生工合成引物,DNAmark(北京鼎国生物试剂公司),PCR仪,紫外分光光度仪,EagleEyeII成像分析系统(美国).
方法
模型建立先按初步规范的脾气虚证大鼠模型造模方法建模[2].造模30d后大鼠表现符合中医学中的脾虚症状.
给药除A组10只大鼠不需造模外,B,C和D组共30只大鼠按文献[2]方法造模30d.A组大鼠胃饲蒸馏水mL,2次/d,连续14d;成模后B组大鼠灌服蒸馏水mL,2次/d,连续14d;成模后C组大鼠灌服桂枝汤滤液,约为6g/kg[3],2次/d,连续喂药液14d;成模后D组大鼠灌服桂枝汤滤液,约为3g/kg,2次/d,连续喂药液14d(C,D两组给药剂量按人与动物间体表面积折算).
细胞悬浊液的制备采用常规方法,大鼠拉颈处死,无菌条件下剪开腹腔取出脾脏研磨,在100目铜网上轻轻挤压,培养基上培育并制成细胞悬液,用低渗压除去红细胞,以Hanks液洗涤,配成1×1010/L及2×1010/L脾细胞悬液.滤过后将收集的脾细胞悬液加到淋巴细胞分离液中,吸出中间灰白色细胞层,用尼龙毛柱T细胞分离法分离T淋巴细胞[4].
增殖刺激重悬T淋巴细胞,调整浓度为1×109/L,用台盼蓝染色,活性细胞>95%,置于24孔培养板中,每孔加细胞悬液1mL,各组内加入卵清蛋白至终浓度g/L,刀豆蛋白A25mg/L,37℃50mL/LCO2孵箱中孵育24h.
PCR将收集培养后的细胞调成细胞悬液,用Trzol提取总RNA,紫外分光光度仪和琼脂糖电泳鉴定RNA的浓度和纯度,-70℃冻存备用.用2μL逆转录试剂盒逆转录合成cDNA,-70℃冻存备用.用5μL逆转录产物进行PCR扩增反应,并以βactin为内对照.IL4,IFNγ和NFAT的引物参照报道[5-7]设计,βactin引物参照Genebank中cDNA序列,具体序列及扩增长度见表1.βactin反应条件:94℃30s变性,50℃30s退火,72℃3min延伸;PCR反应条件:94℃5min变性,然后35个循环的扩增,最后延伸72℃10min.IFNγ每一个循环包括94℃45s,56℃45s,72℃90s;IL4每一循环包括94℃45s,55℃45s,72℃90s,NFATc每一循环包括94℃1min,55℃1min,72℃2min.表1PCR所有引物及扩增长度
扩增反应半定量分析5μLPCR产物经15g/L琼脂糖电泳,溴化乙啶染色,能过像分析读取目的电泳带A值,将目的条带与βactin条带的比值作为目的基因mRNA的表达量,目的基因mRNA的表达量=目的条带A值/βactin条带A值.
学处理:计量资料以x±s表示,组间比较用SPSS软件包进行方差分析及SNKq检验.
2结果
实验各组的NFATmRNA,IL4mRNA,IFNγmRNA的影响(表2).B组的NFATmRNA,IL4mRNA表达上调;而IFNγmRNA表达下调,经C组治疗后,NFATmRNA,IL4mRNA表达下调,IFNγmRNA表达上调,与正常组相比较,基本恢复了正常水平.IFNγ,IL4,NFAT及βactin的扩增产物经15g/L琼脂糖电泳,所示条带分别为405,360,392和512bp,符合设计的片段.表2实验各组NFATmRNA,IL4mRNA及IFNγmRNA的表达
3讨论
1986年Mosman等[6]证实CD4+可以成功能不同的Th1和Th2亚群,它们各自产生特征性细胞因子.Th1细胞主要分泌干扰素γ(interferonγ,IFNγ),IL2,IL12等多种Th1型细胞因子;Th2细胞分泌的IL4,IL5,IL10等多种Th2型细胞因子.Th1细胞和Th2细胞通过细胞因子的交互调节而互为调节细胞,从而形成复杂的细胞因子,例如由Th1细胞分泌的IFNγ是Th1细胞分化的重要的细胞因子,它可抑制Th2细胞的分化.IL4和IL10是Th2细胞分化的重要的细胞因子,可抑制Th1细胞的分化[1].
活化T细胞核因子(nuclearfactorofactivatedTcells,NFAT)是一类与众多信号传导途径相,具有广泛生理功能的转录因子[8].NFAT可以选择性诱导细胞因子和其他免疫调控基因的转录,从而在免疫应答过程中扮演着中心角色[9].
“脾”的防卫功能与免疫功能有许多相似之处,脾与免疫功能之间的关系非常密切[10].桂枝汤组方多以调补脾胃药为基础,桂枝汤以甘草、大枣、生姜三味药升腾脾胃清阳之气,培中土,滋化源,故可改善脾虚状况,增强人体免疫力.桂枝汤治疗前,脾虚组的NFATmRNA,IL4mRNA表达上调;而IFNγmRNA表达下调,说明了脾虚大鼠Th1/Th2细胞失去了平衡,Th细胞向Th2细胞分化,Th细胞向Th1分化途径受到抑制,此时,Th2应答占优势.其机制可能是脾虚大鼠调节因子NFAT表达上调,其通过信号传导途径阻断诱导IFNγ的表达,解除了对IL4表达的竞争抑制作用,从而使IFNγ的表达下调,IL4的表达上调;经桂枝汤大小剂量组治疗后,NFATmRNA,IL4mRNA表达下调,IFNγmRNA表达上调,与正常组相比较,基本恢复了正常水平,说明了桂枝汤可以诱发Th1优势应答,抑制Th2优势应答,最终使脾虚大鼠Th1/Th2细胞达到一种新的动态平衡.
【参考文献】
[1]秦卫兵.Th1和Th2细胞在体内的分化[J].国外医学免疫分册,2002,25:42-46.
[2]周永生,樊雅莉,陈小野,等.脾气虚证动物模型规范化的初步研究-部分免疫功能方面[J].实验动物科学与,2003,20:1-5.
[3]窦如海.实验动物和动物实验技术[M].济南:山东科学技术出版社,2006:126.
[4]王兰兰.免疫学和免疫检验[M].北京:人民卫生出版社,2004:183.
[5]AdachiS,AmasakiY,MiyatakeAN,etal.SuccessiveexpressionandactivationofNFATfamilymembersduringthymocytedifferentiation[J].BiolChem,2000,275(19):14708.
[6]KiddP.Th1/Th2balance:Thehypothesis,itslimitations,andimplicationsforhealthanddiseases[J].AlternMedRev,2003,8:223-246.
[7]魏海明,刘杰,田志刚.检测Th1/Th2亚群的临床意义[J].中华检验医学杂志,1
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