AIHA患者外周血Th1／Th2、Tc1／Tc2亚群的研究及意义

AIHA患者外周血Th1／Th2、Tc1／Tc2亚群的研究及意义

作者：吴伟全，孙炎华，邱少玲

【关键词】自身免疫性溶血性贫血

［摘要］目的：研究自身免疫性溶血性贫血(autoimmunehaemolyticanaemia，AIHA)患者外周血Th1／Th2、Tc1／Tc2亚群极化状态，分析AIHA的免疫学发病机制，为AIHA的临床治疗提供新的理论依据。方法：收集AIHA患者及健康对照组外周抗凝静脉血，分离纯化T细胞。以Cy5标记的抗CD4、CD8单抗和PE标记的CD30单抗作双色流式细胞术，分析AIHA患者Th／Tc、Th1／Th2、Tc1／Tc2亚群的比例变化。结果：与正常对照组相比，AIHA患者外周血CD4+细胞百分率显着降低(P0．05)，CD8+细胞百分率无明显变化(P0．05)，CD4+/CD8+比例明显降低(P0．05)，CD4+CD30-T、CD4+CD30+T细胞百分率明显下降，CD4+CD30-T／CD4+CD30+T和CD8+CD30-T／CD8+CD30+T比例均明显升高(P0．05)，而CD8+CD30-T及CD8+CD30+T细胞百分率无明显变化(P0．05)。结论：AIHA患者外周血存在细胞免疫功能失调，T细胞亚群极化状态发生改变，呈明显Th1／Tc1型细胞优势；Th1／Tc1型细胞介导的细胞免疫可能与AIHA的免疫学发病机制有关。

［关键词］自身免疫性溶血性贫血；T细胞亚群；研究

StudyonTh1／Th2、Tc1／Tc2SubsetsonPeripheralBloodofthePatientswithAutoimmuneHaemolylicAnaemiaandIt‘sSignificance

Abstract:ObjectiveToinvestigatethechangeofTh1likeandTh2likecellsbalanceinautoimmunehaemolyticanaemia(AIHA)patients．MethodsTheratiosofTh／Tc，Th1／Th2andTc1／Tc2inperipheralbloodTcellswereanalyzedbyimmunofiuorescencestainingandbicolorflowcytometry(FCM)invitro．ResultsComparedwiththeratiosofTh1／Th2(48．76％±6．17％)andTc1／Tc2(18．90％±4．12％)inhealthypeople，theratiosofTh1/Th2(56．21％±5．95％)andTc1／Tc2(23．09％±3．31％)inAIHApatientsincreasedobviously．FCManalysisshowedthataveragepercentagesofTh，Th1，Th2，Tc，Tc1andTc2are(22．31％±6．51％)，(21．92％±6．42％)，(0．37％±0．14％)，(32．12％±6．15％),(30．95％±5．45％)and(1．34％±0．84％)inAIHApatientsversus(38．24％±5．82％)，(38．01％±5．47％)，(0．90％±0．16％)，(31．25％±5．63％)，(29．72％±5．20％)and(1．52％±0．68％)inhealthypeople．TheaveragepercentagesofTh,Th1andTh2decreasedobviously．WhiletheaveragepercentagesofTc,Tc1andTc2didnotchanged．ConclusionTheratiosofTh1／Th2andTc1／Tc2inperipheralbloodTcellswereincreasedobviouslyinAIHApatients．ItsuggestedthatcellularimmunityinAIHApatientsisshiftedtoTh1typeimmunity，whichmayrelatetothemechanismofAIHA．

Keywords：Autoimmunehaemolyticanaemia；Tcellsubsets;Study

自身免疫性溶血性贫血(autoimmunehaemolyticanaemia，AIHA)是一种器官特异性的自身免疫性疾病，其发病机制尚未完全明了。研究发现AIHA的发生发展与患者体内T细胞的极化状态有关。目前研究认为CD30可能是Th2、Tc2特异性表面标志物之一，本研究应用PE标记的抗CD30单抗和Cy5标记的CD4、CD8作双色流式细胞术，检测AIHA患者及健康人群外周血T细胞各亚群的百分率。分别以CD4+CD30-T、CD4+CD30+T、CD8+CD30-T及CD8+CD30-T细胞代表Th1、Th2、Tc1及Tc2细胞，并进一步探讨Th1类／Th2类细胞极化漂移在AIHA发病机制中的作用。

1材料与方法

1．1研究对象35例AIHA患者取自本院及广东医学院附属医院血液科，男15例，女20例，年龄3岁~69岁，中位年龄45岁，均符合AIHA诊断标准，并于用药前取外周抗凝血；正常对照35例为健康人群，排除AIHA及其他自身免疫性疾病，其中男16例，女19例，年龄5岁~57岁，中位年龄37岁。

1．2主要试剂和仪器AntiCD4Cy5、AntiCD8Cy5(EB公司)、AntiCD30-PE、MslgG1Cy5、MslgG1PE(Miltenyibiotec公司)、小牛血清、溶血素(0．85％NH4Cl溶液)、hCD3+TcellEnrichmentColumn、淋巴细胞分离液(AXISSHIELD公司)、EPICSXL型流式细胞仪(Beckman公司)。

1．3研究方法

1．3．1外周血T细胞的分离无菌采集患者及正常人外周静脉血4ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离得单个核细胞。无菌玻璃培养皿37℃培养30min，去除黏附于玻璃培养皿的单核细胞，以获取悬浮的淋巴细胞。加入0．85％NH4Cl溶液溶解红细胞，经T细胞分离富聚柱(hCD3+TCellEnrichmentColumn)采用负筛选法获得纯化的T淋巴细胞。用20％的小牛血清RPMI1640培养液调整细胞浓度约2×106/ml。FCM法检测其纯度大于98％，台盼蓝拒染法检测其活性大于97％。

1．3．2Th、Tc、Th1、Th2、Tc1、Tc2亚群的测定取3支试管，各加入100μlT细胞悬液，3管分别加入小鼠抗人单克隆IgG1PE和小鼠抗人单克隆IgG1Cy5(阴性对照管)、抗CD4Cy5和CD30-PE(CD4+管)、抗CD8-Cy5和抗CD30PE(CD8+管)，各种标记抗体均15μl，混匀，4℃避光30min，PBS洗涤2次，各管加入0．5ml缓冲液，上流式细胞仪检测。

1．4统计分析所有结果以±s表示，两两比较采用成组t检验，经SAS8．22软件分析，取P0．05有统计学意义。

2结果

2．1Th、Tc、Th／Tc细胞的检测结果AIHA患者外周血Th细胞百分率及Th／Tc比例明显下降，与正常人群比较差别有统计学意义(P0．05)；Tc细胞百分率无明显变化，与正常人群比较差别无统计学意义(P0．05)(见表1)。

表1AIHA患者及正常人外周血Th、Tc细胞的检测(略)

注：与正常对照组比较，*P0．05；**P0．05

2．2Th1、Th2、Tc1、Tc2、Th1／Th2、Tc1／Tc2的检测结果AIHA患者外周血Th1、Th2细胞百分率明显下降，与正常人群比较差别有统计学意义(P0．05)：Tcl、Tc2细胞百分率无明显变化，与正常人比较差别无统计学意义(P0．05)；Th1／Th2及Tc1／Tc2比例升高，与正常人比较差别有统计学意义(P0．05)，见表2。

表2AIHA患者及正常人群外周血Th1/Th2、Tc1／Tc2细胞的检测(略)

注：与正常对照组比较，*P0．05；**

3讨论

自身免疫病是临床上常见的一类疾病，然而引起自身免疫病的原因和机制十分复杂，目前尚未完全明了。可能与自身抗原的出现、免疫调节异常、Fas／FasL表达异常等多种因素有关，根本原因可能是自身成分具有免疫原性和／或自身免疫耐受的破坏，发生持久和过度的自身免疫应答。

目前研究资料表明，Th／Ts(CD4+／CD8+)细胞的平衡在自身免疫病的发生发展过程中起重要作用。CD4是T辅助／诱导细胞(Th／Ti)的表面标志，CD4+T细胞具有辅助T细胞转变成效应细胞、B细胞转化成浆细胞以及活化巨噬细胞等功能。起辅助、诱导细胞及体液免疫的作用。CD8是抑制／杀伤T细胞(Ts／Tc)的表面标志，CD8+T细胞具有细胞毒效应及抑制T细胞活化、抑制B细胞产生抗体，起抑制细胞及体液免疫的作用。Th／Ts(CD4+/CD8+)比例变化反映了机体的免疫功能状况，比例升高表明免疫功能亢进，比例降低表明免疫功能低下。本研究发现，AIHA患者CD4T百分率及CD4+／CD8+比例均明显降低，CD8+T百分率无明显变化。结果提示，AIHA患者Th／Ti数量及比例降低，反应了AIHA患者体内存在细胞免疫调节异常，AIHA患者可能存在T细胞免疫功能低下，但是自身反应性T细胞可能是异常活化的。

人类CD4+T细胞根据其分泌的细胞因子不同至少可分为Th0、Th1、Th2三个亚群。其中Th1亚群可分泌IL2、IFNγ等细胞因子，促进细胞免疫，激活细胞毒T细胞，巨噬细胞，吞噬杀伤靶细胞，也可分泌TNFα、β等细胞因子作用于靶细胞；Th2亚群主要分泌IL4、IL5、IL10等细胞因子而促进体液免疫反应。近年来研究发现，人类CD8+T细胞至少可分为Tcl、Tc2两个亚群。Tc1与Th1相似，可分泌IL2、IFNγ等细胞因子：Tc2与Th2相似，可分泌IL4、IL5、IL10等细胞因了［3］。Mosmann等［4］将Th1／Tc1、Th2／Tc2细胞分别称为Th1类、Th2类细胞。Th细胞间的平衡状态与多种疾病的发生发展密切相关，Alves等认为Th1／Th2细胞间的平衡，是体内体液免疫及细胞免疫间重要的调节枢纽。因此，建立一种准确、灵敏、快速的检测Th的方法十分必要。目前检测Th1／Th2的方法有多种，其基本原理都是外周血淋巴细胞经刺激后，检测培养液中细胞因子的含量，或者检测细胞内细胞因子的表达。但是它们都无法判断所分泌的细胞因子是来自CD4+T细胞或是其他单个核细胞，所以并不能真正地检测出Th细胞的极化状态。

Thl类／Th2类细胞间的平衡状态对研究包括AIHA在内多种自身免疫病有重要意义，然而，长期以来，一直缺乏一种特异性表面标志以区别Th1类／Th2类细胞。近年来有研究发现CD30是检测Th2和Tc2细胞可靠的表面标志，DelPrete等［1］研究发现Th1细胞克隆基本上不表达CD30mRNA，其CD30膜结合形式及可溶性形式水平也检测不到，而在Th2细胞克隆，CD30mRNA及CD30膜蛋白结合形式则大量表达，并释放出大量的sCD30。Chilosi等［5］从一名类Omenm综合征(OLS)患者外周血中分离出的CD30+T细胞形成的集落中，绝大多数具有Th2细胞特征，而CD30T细胞集落多数是Th1细胞。Nakamura等［6］研究发现，IL4能施用诱导CD30在活化的CD4+T细胞上表达，在内源性IL4缺失的状态下，Th2细胞会失去CD30表达的能力。目前国外相关研究均表明CD30是Th2细胞的标志之一。本研了以PE标记的抗CD30单抗测得的正常人外周血T细胞中CD4+CD30+T(Th2)细胞为(0．80±0．16)％，与Nagata等［7］的结果相似。因此我们可以运用CD30或sCD30的表达水平来分析Th2细胞在一些疾病发病机制中的作用，可为疾病的活动性、预后评估等方面提供一定的帮助，但其价值还有待进一步研究。

AIHA是一种常见的自身免疫性疾病，临床上以溶血性贫血为主要特征。主要是由于服用药物或病毒感染后，使红细胞膜表面成分发生改变，从而刺激机体产生抗红细胞的自身抗体，这种抗体与自身改变的红细胞结合导致红细胞破坏增加所致。然而，越来越多的资料显示，除体液免疫机制外，细胞免疫起着非常重要的作用。本研究应用流式细胞术检测纯化的外周血T细胞，分别以CD4+T细胞，CD8+T细胞代表Th、Tc细胞，以CD30区分Th1类和Th2类细胞。我们的结果发现AIHA患者外周血Th1类／Th2类细胞间失衡，呈现明显Th1类优势，这一结论与Fagiolo等［8，9］的报道一致。同时，我们发现，尽管AIHA患者Th细胞下降，Tc细胞无明显变化，然而Th1／Th2及Tc1／Tc2比例均明显升高，提示在AIHA的发病过程中，Th1类／Th2类比例较Th和Tc细胞数所起的作用更为明显。AIHA患者体内Th1类／Th2类比例升高，提示机体自身反应性细胞免疫功能亢进。在AIHA发生发展过程中，Th1细胞可通过分泌IL2、IFNγ等细胞因子，激活细胞毒T细胞、巨噬细胞，杀伤红细胞；而活化的Tc1细胞，也就是通常所说的Tc细胞，则能通过分泌穿孔素、颗粒酶特异性地杀伤红细胞［10，11］。

本研究表明，通过对Th1类/Th2类细胞平衡在AIHA中的作用的研究，不仅有助于阐明AIHA的发病机制，而且有可能为我们提供治疗AIHA的新方法，即通过调节Thl类/Th2类细胞的动态平衡，来调节过强的体液免疫或细胞免疫，达到治疗自身免疫病的目的［12］。

参考文献：

［1］DelPreteG，CarliM，D’EliosMM，etsignalingpromotesthedeveloPmentofhumanThelpertype2likeTcells［Ｊ］．JxepMed,1995,182(6)：16651669．

［2］张之南.血液病诊断及疗效标准［M］．第2版.北京：北京科学出版社，1998．

［3］WoodlandDL，DuttonofCD4(+)andCD8(+)Tcells［Ｊ］．CurrOpinImmunol．2003,15(3)：336342．

［4］MosmannTR，SadexpandinguniverseofTcellsubsets：Th1，Th2andmore［J］.ImmunolToday,1996，17(3)：138146．

［5］EliosMM，RomagnaniP，ScalettiC，etal．InvivoCD30expressionindiseaseswithpredominantactivtionofTh2likeTcell［Ｊ］．JleikocBiol,1997,61(5)：3943．

［6］NakamuraT，LeeRK，NamSY，etal．ReclprocalregulationofCD30expressiononCD4+TcellbylL4andIFNgamlna［Ｊ］．JImmunol，1997,158(5)：20902097．

［7］NagataK，TanakaK，OgawaK，etal．selectiveexpressionofanovelsurfacemoleculebyhumanTh2cellsinvivo［J］．JImmunol,1999,162(3)：12781286．

［8］FagioloE，TorianiTerenziC．Th1andTh2