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文档简介
微生物限度标准第一页,共七十二页,编辑于2023年,星期二一、2005年版微生物限度标准的控制项目
杂菌数:细菌数、霉菌和酵母菌数。控制菌(致病菌):大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌。第二页,共七十二页,编辑于2023年,星期二
二、2005年版微生物限度标准的制订原则2000年版:细菌数、酵母菌数和霉菌数按剂型制订;控制菌(致病菌)按给药途径制订。2005年版:均按给药途径制订。制定原则:非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径、及对患者健康潜在的危害而制订的。修订理由:同一剂型有不同的给药途径;新的剂型不断出现;国外药典的限度标准制订原则统一。第三页,共七十二页,编辑于2023年,星期二三、2005年版微生物限度标准的应用
本版药典明确指出:药品的生产、贮存、销售过程中的检验,原料及辅料(中药提取物)的检验,新药标准制订、进口药品标准复核、考察药品质量及仲裁等,除另有规定外,其微生物限度均以本标准为依据。第四页,共七十二页,编辑于2023年,星期二四、2005年版微生物限度标准的分类1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂应符合无菌检查法规定。第五页,共七十二页,编辑于2023年,星期二2.口服给药制剂
不含药材原粉的制剂含药材原粉的制剂*含豆豉、神曲等发酵成分的制剂*第六页,共七十二页,编辑于2023年,星期二3.局部给药制剂
⑴用于手术、烧伤及严重损伤的局部给药制剂⑵用于表皮或黏膜不完整的含药材原粉的局部给药制剂
⑶用于表皮或黏膜完整的含药材原粉的局部给药制剂⑷眼部给药制剂⑸耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂⑹阴道、尿道给药制剂⑺直肠给药制剂⑻其它局部给药制剂第七页,共七十二页,编辑于2023年,星期二
含动物组织(包括提取物)及动物类原药材(蜂蜜、王浆、动物角、阿胶除外)的口服给药制剂:每10g或10ml还不得检出沙门。有兼用途径的制剂,应符合各给药途径的标准。霉变、长螨者以不合格论。原料(中药提取物)及敷料,参照相应制剂的微生物限度标准执行。第八页,共七十二页,编辑于2023年,星期二五、2005版制剂通则项下的
微生物限度要求
第九页,共七十二页,编辑于2023年,星期二2005版化学药制剂通则项下的微生物限度要求无菌检查:注射剂、植入剂*、冲洗剂*。无菌检查及微生物限度检查:软膏剂、乳膏剂*、糊剂*、眼用制剂、气雾剂、喷雾剂、散剂、耳用制剂、鼻用制剂*、凝胶剂*、洗剂、灌肠剂*。
微生物限度检查:局部用片剂*、酊剂*、栓剂*、糖浆剂*、膜剂*、粉雾剂、口服溶液剂、口服混悬剂、口服乳剂、搽剂、涂剂*、涂膜剂*、贴剂*。原则性要求:丸剂、口服片剂、胶囊剂、颗粒剂。第十页,共七十二页,编辑于2023年,星期二
新增的无菌检查化学药品制剂
鼻用制剂:用于手术或创伤的鼻用制剂。
凝胶剂:用于严重创伤的凝胶剂。
乳膏剂:用于烧伤或严重创伤的乳膏剂。
第十一页,共七十二页,编辑于2023年,星期二2005版中药制剂通则项下的微生物限度要求无菌检查:注射剂。无菌检查及微生物限度检查:散剂*、软膏剂*、眼用制剂*、鼻用制剂*、气雾剂*、喷雾剂*。微生物限度检查:丸剂、颗粒剂、片剂、锭剂、煎膏剂、胶剂、糖浆剂、贴膏剂*、合剂、滴丸剂、胶囊剂、酒剂、酊剂、流浸膏剂、浸膏剂、凝胶剂*、露剂、茶剂、搽剂*、洗剂*、涂膜剂*、栓剂。不要求:膏药第十二页,共七十二页,编辑于2023年,星期二
新增的无菌检查中药制剂
散剂:用于烧伤或严重创伤的外用散剂。
软膏剂:用于烧伤或严重创伤的软膏剂。
眼用制剂:用于伤口的眼用制剂。
鼻用制剂:用于严重创伤的鼻用制剂。气雾剂、喷雾剂:用于烧伤或严重创伤的气雾剂、喷雾剂。
第十三页,共七十二页,编辑于2023年,星期二
2005版三部制剂通则项下的微生物限度要求
无菌检查:注射剂、外用溶液剂、灌洗剂。微生物限度检查:片剂*、栓剂、胶囊剂*、散剂、颗粒剂*、气雾剂。
无菌检查或微生物限度检查:软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、喷雾剂、眼用制剂、鼻用制剂。
第十四页,共七十二页,编辑于2023年,星期二
六、品种项下的微生物限度要求
敷料:乳糖、淀粉、糊精、玉米、精致玉米油等。
纯化水:微生物限度检查取本品,采用薄膜过滤法处理后,依法检查(附录XIJ),细菌、霉菌、和酵母菌总数每1mL不得过100个。注射用水:微生物限度检查取本品至少200mL,采用薄膜过滤法处理后,依法检查(附录XIJ),细菌、霉菌、和酵母菌总数每100mL不得过10个。
第十五页,共七十二页,编辑于2023年,星期二
微生物限度检查法
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受微生物污染程度的方法,检查项目包括染菌量及控制菌检查。
第十六页,共七十二页,编辑于2023年,星期二起草的指导思想:完善检查法.增加试验的可操作性.使方法更具科学性,保证检验结果的准确性.微生物限度检查法
第十七页,共七十二页,编辑于2023年,星期二增、修订内容(1)-总则操作环境洁净度:100级单向流空气区域,环境10000级。定期检测:《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌、和沉降菌的测试方法》。霉菌、酵母菌培养温度为23~28℃。细菌培养温度为30~35℃。结果报告:以1g、1ml、10g、10ml
或10cm2为单位报告。第十八页,共七十二页,编辑于2023年,星期二增、修订内容(2)-检验量
随机抽取不少于检验量(两个以上最小包装单位)的3倍。贵重、微量样品的检验量可以酌减。
要求检查沙门菌的供试品其检验量应增加10g或10ml。
第十九页,共七十二页,编辑于2023年,星期二增、修订内容(3)-供试液制备表面活性剂、中和剂或灭活剂:应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1小时。供试液的体积:100ml。非水溶性供试品:增加“十四烷酸异丙酯法”。结肠溶制剂供试品:用pH7.6无菌磷酸盐缓冲液溶解。第二十页,共七十二页,编辑于2023年,星期二增、修订内容(4)——灭菌培养基及稀释剂等灭菌:采用验证合格的灭菌程序进行灭菌。第二十一页,共七十二页,编辑于2023年,星期二增、修订内容(5)——稀释剂稀释剂:pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液
pH6.8无菌磷酸盐缓冲液
pH7.6无菌磷酸盐缓冲液
第二十二页,共七十二页,编辑于2023年,星期二增、修订内容(6)-细菌、霉菌及酵母菌计数计数方法:平皿法、薄膜过滤法。第二十三页,共七十二页,编辑于2023年,星期二
目的:增加试验方法的完整性、保证检验结果的可靠性。
何时验证:建立供试品的微生物限度检查法时;供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时。试验菌株:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草杆菌。细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证⑴第二十四页,共七十二页,编辑于2023年,星期二细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证⑵菌液制备:50~100cfu/ml。验证方法:试验组、菌液组、供试品对照组、稀释剂对照组。结果判断:供试品组的菌回收率、对照组的菌回收率。均不低70%。第二十五页,共七十二页,编辑于2023年,星期二细菌、霉菌、酵母菌计数-平皿法培养时间霉菌和酵母菌计数菌数报告规则第二十六页,共七十二页,编辑于2023年,星期二细菌、霉菌、酵母菌计数-薄膜过滤法方法菌数报告规则第二十七页,共七十二页,编辑于2023年,星期二增、修订内容(7)-控制菌检查沙门菌检查法:用培养基直接制成供试液进行增菌培养。大肠菌群检查法梭菌检查法第二十八页,共七十二页,编辑于2023年,星期二控制菌检查法的验证目的:增加试验方法的完整性保证检验结果的可靠性。何时验证:建立供试品的微生物限度检查法时;供试品组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时。试验菌株:按规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。阴性菌对照菌株第二十九页,共七十二页,编辑于2023年,星期二控制菌检查法的验证菌液制备:50~100cfu/ml。验证方法:试验组、阴性菌对照组。结果判断:试验组应检出、阴性菌对照组不得检出。第三十页,共七十二页,编辑于2023年,星期二微生物限度检查法
第三十一页,共七十二页,编辑于2023年,星期二检验量检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。
第三十二页,共七十二页,编辑于2023年,星期二
除另有规定外,一般供试品的检验量为10g或10ml;中药膜剂为50cm2;化学膜剂为50cm2贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品其检验量应增加10g或10ml。
第三十三页,共七十二页,编辑于2023年,星期二
供试液的制备
根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需用水浴加温时,温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1小时。第三十四页,共七十二页,编辑于2023年,星期二
除另有规定外,常用的供试品制备方法1.液体供试品2.固体供试品3.特殊供试液制备方法(1)非水溶性供试品①司盘80②十四烷酸异丙酯第三十五页,共七十二页,编辑于2023年,星期二
(2)非水溶性膜剂供试品①肠溶及结肠溶供试品
②气雾剂、喷雾剂供试品第三十六页,共七十二页,编辑于2023年,星期二
(3)具抑菌活性的供试品
当供试品有抑菌活性时,应消除其抑菌活性后,再依法检查。常用的方法有:
①加大培养基量稀释法②离心沉淀集菌法③薄膜过滤法④中和法第三十七页,共七十二页,编辑于2023年,星期二细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证1、计数方法的验证当建立药品的微生物限度检查法时,应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证,以确认该计数方法的可靠性。若供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时,应进行计数方法可靠性的再验证。验证时,按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。
第三十八页,共七十二页,编辑于2023年,星期二
菌种
验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代),以保证试验菌株的生物学特性。应采用适宜的保存技术,防止试验菌株发生变异。第三十九页,共七十二页,编辑于2023年,星期二方法验证
CPBPUSPJP菌株大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠球菌黑曲霉大肠埃希菌金黄色葡萄球菌白色念珠球菌枯草芽孢杆菌大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠球菌黑曲霉大肠埃希菌金黄色葡萄球菌沙门菌加入菌量(cfu)50~100100105-106103检验方法中和法平皿法稀释法离心沉淀法薄膜过滤法中和法平皿法稀释法薄膜过滤法中和法平皿法稀释法薄膜过滤法平皿法稀释法平板表面涂抹法薄膜过滤法第四十页,共七十二页,编辑于2023年,星期二菌液制备用无菌0.9%氯化钠溶液制成每1ml含50~100cfu的菌悬液和50~100cfu的孢子悬液。菌种培养基培养温度(℃)培养时间(h)大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠球菌黑曲霉营养肉汤培养基改良马丁培养基35~3723~2818~2424~485~7(天)第四十一页,共七十二页,编辑于2023年,星期二黑曲霉菌液的制备
新鲜培养的黑曲霉斜面中加入3~5ml0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。然后,吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内,用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~00cfu的孢子悬液。第四十二页,共七十二页,编辑于2023年,星期二
验证方法
验证试验至少应进行3次独立的平行试验,并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
⑴试验组:平皿计数时,取试验可能用的最低稀释级供试液,加入50~100cfu试验菌,分别注入平皿中,立即倾注琼脂培养基,每株菌平行制备2个平板,按菌落计数方法测定其菌数。薄膜过滤法计数时,应在最后一次的冲洗液中加入试验菌。
第四十三页,共七十二页,编辑于2023年,星期二
⑵菌液组:测定所加的试验菌数。
⑶供试品对照组:测定供试品本底菌数。
⑷稀释剂对照组:若供试液制备需要分散、乳化,中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时,用相应的稀释液替代供试品,加入试验菌,使最终菌浓度为每1ml供试液含50~100cfu。
第四十四页,共七十二页,编辑于2023年,星期二
结果判定
在3次独立的平行试验中,稀释剂对照组、试验组的回收率均不低于70%,若任一次试验中回收率低于70%,应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新验证。
验证试验可与供试品的细菌,霉菌及酵母菌计数同时进行。
第四十五页,共七十二页,编辑于2023年,星期二检查法
计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。
检查时,按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。
取按已验证方法制备的均匀供试液或原药液,用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液稀释成1∶102、1∶103等稀释级。
第四十六页,共七十二页,编辑于2023年,星期二
平皿法薄膜过滤法
阴性对照试验
培养和计数第四十七页,共七十二页,编辑于2023年,星期二控制菌检查
控制菌检查方法的验证
当建立药品的微生物限度检查法时,应进行控制菌检查方法的验证,以确认所采用的方法适合于供试品的控制菌检查。若供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时,检查方法应重新验证。
验证时,依各供试品微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株,验证大肠菌群检查法时,应采用大肠埃希菌作为验证菌株。按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。
第四十八页,共七十二页,编辑于2023年,星期二菌液制备用无菌0.9%氯化钠溶液制成每1ml含10~100cfu的菌悬液菌种培养基培养温度(℃)培养时间(h)大肠埃希菌金黄色葡萄球菌乙型副伤寒沙门菌铜绿假单胞菌生孢梭菌营养肉汤硫乙醇酸盐流体35~3718~24第四十九页,共七十二页,编辑于2023年,星期二
验证方法
⑴试验组:取规定量供试液及10~100cfu试验菌加入增菌培养基中,依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时,试验菌应加在最后一次冲洗液中,冲洗后,接入增菌培养基中。
第五十页,共七十二页,编辑于2023年,星期二⑵阴性菌对照试组:设立阴性菌对照试是为了验证该控制菌检查方法的特异性,方法同试验组,验证大肠埃希菌、大肠群、沙门菌检查法时的阴性菌对照采用金黄色球菌,验证铜绿假单胞菌、金黄色球菌、梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不的检出。
第五十一页,共七十二页,编辑于2023年,星期二结果判断阴性菌对照组不得检出阴性菌。若试验组检出试验菌,按此供试液制备方法和控制菌检查法进行控制菌检查;若试验组检未出试验菌,应采取有效方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行方法验证。验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。第五十二页,共七十二页,编辑于2023年,星期二结果判断
1、供试品检出控制菌或其它致病菌时,按一次检出结果为准,不再复试。
2、供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定,应从同一批样品中随机抽样,独立复试两次,以3次结果的平均值报告菌数。
第五十三页,共七十二页,编辑于2023年,星期二3、眼用制剂检出霉菌和酵母菌时,须以两次复试结果均不得长菌,方可判供试品的霉菌和酵母菌数符合该品种项下的规定。
4、若供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数及控制菌三项检验结果均符合该品种项下的规定,判供试品符合规定;若其中任何一项不符合该品种的规定,判供试品不符合规定。
第五十四页,共七十二页,编辑于2023年,星期二大肠埃希菌
CPBPUSPJP方法MUG法IMVICIMVICIMVIC检验量(g或ml)1111稀释剂pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液pH7.6磷酸盐缓冲液pH6.8无菌磷酸盐缓冲液乳糖肉汤培养基乳糖液体培养基乳糖液体培养基预增菌+增菌胆盐乳糖35~37℃18~24hMUG.5~24hMac肉汤43~45℃18~24h乳糖液体培养基35~37℃18~24hEC液体培养基45℃+-0.224h分离EMB琼脂平版35~37℃18~24hMac琼脂平版43~45℃18~24hEMB、Mca琼脂平版35~37℃24~48hEMB琼脂平版35℃24h生化试验++++第五十五页,共七十二页,编辑于2023年,星期二铜绿假单胞菌
CPBPUSPJP检验量(g或ml)1110稀释剂pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液pH7.6磷酸盐缓冲液pH6.8无菌磷酸盐缓冲液pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液pH7.2磷酸盐缓冲液大豆蛋白消化培养基增菌胆盐乳糖35~37℃18~24h大豆蛋白消化培养基35~37℃24h大豆蛋白消化培养基35~37℃24~484h分离溴化铵十六烷基三甲基琼脂培养基35~37℃18~24h溴化铵十六烷基三甲基琼脂培养基溴化铵十六烷基三甲基琼脂培养基生化试验+++第五十六页,共七十二页,编辑于2023年,星期二金黄色葡萄球菌
CPBPUSPJP检验量(g或ml)11101稀释剂pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液pH7.6磷酸盐缓冲液pH6.8无菌磷酸盐缓冲液pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液大豆蛋白消化培养基SCD增菌营养肉汤(或含亚碲酸钾培养基35~37℃18~24h大豆蛋白消化培养基35~37℃24h大豆蛋白消化培养基35~37℃24~484hSCD30~35℃24~48h分离甘露醇氯化钠琼脂平板卵黄氯化钠琼脂平板35~37℃24~724hBP琼脂平板35~37℃24~484h甘露醇氯化钠琼脂平板BP琼脂平板35~37℃24~484h7.5%SCD琼脂平板35~37℃24~484h凝固酶试验++++第五十七页,共七十二页,编辑于2023年,星期二沙门菌
CPBPUSPJP检验量(g或ml)10101010稀释剂乳糖肉汤培养基乳糖液体培养基乳糖液体培养基增菌营养肉汤培养基35~37℃18~24h乳糖肉汤培养基35~37℃5~24h乳糖液体培养基35~37℃24~48h乳糖液体培养基30~35℃24~72h二次增菌TTB液体培养基35~37℃18~24hTTB液体培养基42~43℃18~244hSC、TTB液体培养基35~37℃24~484hTTB液体培养基35~37℃12~24h分离EMB、MacDHL(或沙门、志贺菌属琼脂)平板35~37℃18~24hDC、XLD琼脂平板43~45℃24~48hBG、XLD、BC琼脂平板35~37℃24~48hXLD及亚硫酸铋琼脂平板、亮绿琼脂平板、30~35℃24~48h生化试验++++第五十八页,共七十二页,编辑于2023年,星期二梭菌
检验量(g或ml)10ml(相当于供试品1g\ml)2份稀释剂pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液增菌0.1%新鲜疱肉100ml0.1%新鲜疱肉100ml36±1℃80℃保温10分钟迅速冷却72~96h36±1℃72~96h分离含庆大霉素的哥伦比亚琼脂平板36±1℃48~72h生化试验过氧化氢酶第五十九页,共七十二页,编辑于2023年,星期二梭菌的检验程序供试品→供试液10ml(相当于供试品1g、1ml)
↓80℃10min∣迅速冷却|
↓↓100ml0.1%疱肉培养基↓35~37℃厌氧72~96h
┌────────────┐
产气、碎肉消化恶臭不产气、无消化碎肉,无恶臭↓0.2ml涂抹↓含庆大霉素的哥伦比亚琼脂平板35~37℃厌氧48~72h报告┌──────────┐有菌落生长无菌落生长↓↓过氧化氢酶试验,镜检报告┌──────────┐过氧化氢酶阴性,革兰阳性梭菌非左述反应报告检出报告未检出第六十页,共七十二页,编辑于2023年,星期二大肠菌群
方法试管法检验量(g或ml)0.1、0.01、0.001稀释剂pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液增菌胆盐乳糖10m3支分离EMB琼脂(麦康凯琼脂)平版确认试验乳糖发酵大肠菌群最可能数第六十一页,共七十二页,编辑于2023年,星期二
大肠菌群检查程序供试液
↓
10ml胆盐乳糖发酵管
↓35~37℃18~24h┌────────────┐不产酸、不产气产酸、产气↓↓大肠菌群阴性曙红亚甲蓝琼脂平板↓或麦康凯琼脂平板报告↓35~37℃18~24h
┌────────────┐
无典型菌落革兰阴性无芽孢杆菌↓↓报告乳糖发酵管
↓35~37℃18~24h
┌─────────┐产气不产气↓↓大肠菌群阳性大肠菌群阴性↓↓报告报告第六十二页,共七十二页,编辑于2023年,星期二
表3大肠菌群最可能数表
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