北中大中药化学实验指导02基本实验项目-3粉防己生物碱的提取、分离和鉴识

实验三粉防己生物碱的提取、分离和鉴识粉防己亦称汉防己,为防己科植物汉防己（Stephaniatetrandra）的干燥根，是临床常用中药。具有祛风湿、止痛、利水消肿、泻下焦湿热等功效。现代药理实验研究表明，汉防己总生物碱具有镇痛、消炎、降压、肌肉松弛以及抗菌、抗肿瘤作用，为主要有效成分。粉防己中生物碱含量高达5%~2.3%，其中主要为汉防己甲素（tetrandrine）和汉防己乙素(fangchineline，又称防己诺林)，还含少量的轮环藤酚碱（cyclanoline）。它们的物理性质如下：1.汉防己甲素和汉防己乙素均为双苄基异喹啉衍生物，氮原子呈叔胺状态。汉防己甲素R=CH3汉防己乙素R=H汉防己甲素为无色针状结晶，丙酮中结晶有双熔点：126～127℃/217～218℃。即，在126～127℃先融化，继续加热至153℃固化，温度上升至217～218℃全熔。不溶于水，石油醚，易溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂及稀酸水溶液。UV：λ0.01NHClmax280nm（ε6887）IR：υKBrmax（cm-1）3050，2800，1605，1580，1235，1215，840汉防己乙素为细棒状结晶，同样有双熔点现象，丙酮中结晶mp134～136℃/238～240℃，甲醇中结晶mp177～179℃/238～240℃。溶解度与汉防己甲素相似，，但极性稍大，故在冷苯中溶解度小于汉防己甲素，而在乙醇中的溶解度大于汉防己甲素。具有隐性酚羟基，不溶于NaOH溶液。2.轮环藤酚碱轮环藤酚碱氯化物无色八面体状结晶，mp214～216℃碘化物无色绢丝状结晶，mp185℃苦味酸盐黄色结晶，mp154～156℃轮环藤酚碱为水溶性季铵型生物碱，不溶于低级性有机溶剂。UV：λMeOHmaxnm（logε）223（4.18），286（3.88）IR：υKBrmax（cm-1）3200，1610，1580，1500，1280，1245，885，800一、实验目的掌握生物碱的乙醇提取方法以及脂溶性生物碱与水溶性生物碱分离。脂溶性碱中酚性碱与非酚性碱的分离，水溶性碱与水溶性杂质的分离。学习用吸附柱层析法分离生物碱。学习生物碱的鉴识方法如：色谱法，化学法等。二、实验原理根据大多数生物碱或生物碱盐能溶于乙醇的通性，用乙醇回流提取法提取总碱，利用季铵型生物碱易溶于水，不溶于亲脂性有机溶剂的性质用溶剂萃取法分离脂溶性生物碱和水溶性生物碱，利用汉防己甲素、乙素极性的差别，用吸附柱层析法分离二者。利用季铵型生物碱可与雷氏铵盐产生沉淀的性质使其与其它水溶性成份分离。三、分离流程防己粗粉乙醇回流提取乙醇提取液减压回收乙醇浓缩物酸水溶解，过滤酸水液氨水碱化（PH9~10）乙酸乙酯－环己烷萃取碱水层有机层过滤水洗至中性酸化（PH3~4）回收溶剂酸水液抽松加雷氏铵盐抽松物（称重）过滤丙酮溶解沉淀Al2O3拌样干燥样品丙酮溶解Al2O3柱层析分离过滤环己烷－丙酮洗脱丙酮液Al2O3柱层析净化汉防己甲素汉防己乙素丙酮-水洗脱洗脱液回收丙酮Ag2SO4处理BaCl2沉淀,过滤轮环藤酚碱盐酸盐四、实验材料1.原料：粉防己粗粉：100g2.溶剂：90～95％乙醇550ml；丙酮100ml；环己烷200ml；乙酸乙酯200ml。3.试剂：盐酸；NaOH；浓NH3˙H2O少许；雷氏铵盐饱和水溶液50ml；0.5％Ag2SO4；10％BaCl2；碱性Al2O3（100～200目）20g；固体NH4Cl；无水硫酸钠；碘甲烷0，5ml；pH试纸少许；硅胶G。4.显色剂：改良Dragendroff试剂5.定性试剂：碘－碘化钾试剂；苦味酸饱和液；硅钨酸试剂；碘化铋钾试剂五、实验方法（一）总生物碱的提取称取粉防己粗粉100g置500ml圆底烧瓶中，加90～95％EtOH回流提取二次（300ml，1小时；250ml，45分钟），过滤，二次提取液合并，减压回收乙醇至无醇味，得提取物。（二）分离1.亲脂性生物碱与水溶性生物碱的分离在（一）所得提取物中加入1％的盐酸约100ml充分搅拌使生物碱溶解，放置，过滤，滤渣用水洗涤一次后弃去。滤液合并后移至500ml分液漏斗中加70ml乙酸乙酯-环己烷（3:1）混合溶剂，再滴加浓氨水调PH9～10，（此时再向水层滴加浓氨水至再无沉淀析出），振摇萃取，静置分层后放出乙酸乙酯-环己烷（3:1）层，碱水层再以新的乙酸乙酯-环己烷（3:1）萃取4次（50ml×1，40ml×3次），最后一次萃取的乙酸乙酯-环己烷（3:1）层中应基本没有生物碱时，认为乙酸乙酯-环己烷（3:1）萃取基本完全（取乙酸乙酯-环己烷层液滴在滤纸上，Dragendroff试剂显色不明显为止）。合并乙酸乙酯-环己烷液即为亲脂性生物碱的提取液，碱水层则为水溶性生物碱提取液。乙酸乙酯-环己烷层用蒸馏水洗至中性，回收溶剂后，残留物抽松，称重,即得脂溶性总生物碱。2.季铵型生物碱的分离纯化“1”项中得到的碱水液过滤，滤液加6NHCl调PH3~4，过滤，滤液加雷氏铵盐的饱和水溶液至不再生成沉淀为止。滤取沉淀，少量水洗涤，抽干，自然干燥。称重，用此沉淀的20倍量(CH3)2CO溶解，自然过滤，滤去不溶物，丙酮液通过Al2O3柱除杂质（Al2O3约10g干法装柱），并用稀丙酮（丙酮:水＝5:1）洗至流出液色极浅为止。再此洗脱液中加入0.5％Ag2SO4溶液至不再生成沉淀（记录所用Ag2SO4的毫升数）。放置，自然过滤，弃去沉淀。滤液回收大部分丙酮，放冷（如有沉淀物再过滤）小心加入与Ag2SO4等mol的2％BaCl2溶液，放置，自然过滤，滤液转入蒸发皿中，水浴上浓缩至小体积（约2～3ml），趁热转入小三角瓶中，放置析出无色结晶，得轮环藤酚碱盐酸盐。如有必要可用H2O重结晶一次。分子量：Ag2SO4311.80BaCl2203.253.汉防己甲素和乙素的分离纯化吸附剂：碱性Al2O3100～200目，Ⅱ～Ⅲ级，20g,层析柱：2.5×25cm样品：拌样。取“1”中所得抽松物200mg用少量丙酮溶解，取0.5～1gAl2O3吸附剂于小蒸发皿中，边滴加样品的丙酮溶液于吸附剂中分散均匀，边加热挥去丙酮，研细待用。装柱：干法装柱或湿法装柱都可以。洗脱剂：环己烷-丙酮（2:1）。将吸附有样品液的Al2O3加于柱顶，倒入洗脱剂，进行层析分离，流速控制在约5ml/分钟，收集各流份约20ml/份，共收集8份。各流份回收溶剂，用硅胶GTLC检查，合并相同的流份，回收溶剂至干，分别用(CH3)2CO重结晶1～2次，可得汉防己甲素、乙素精品。附：（1）湿法装柱法：取吸附剂20g左右于烧杯中，加洗脱剂一定量湿润，搅匀。半打开层析柱活塞，控制流速，将吸附剂缓缓倒入柱内，待其自然沉降后即可，柱顶留1cm左右洗脱剂，倒入拌好的样品，敲平（此时洗脱剂不能被样品吸干，应有余量）。即可开始层析。（2）干法装柱：打开柱活塞，均匀倒入干的吸附剂敲平，然后倒入拌样的吸附剂再敲平，沿柱壁均匀加入洗脱剂，待流出第1滴流出液时，加满洗脱剂，开始层析。（3）硅胶GTLC制备与层析：铺板：板规格15×5cm，一块板用吸附剂1～1.5g，加0.3％CMC水溶液3～4.5ml,在乳钵中研匀后铺板，自然干燥后在100～105℃活化30分钟。层析条件：对照品：总碱丙酮液展开剂：CHCl3-(CH3)2CO1:1,展开前氨水饱和15分钟。显色剂：改良Dragendroff试剂（三）鉴识1.层析鉴识硅胶GTLC对照品：汉防己甲素丙酮液1mg/ml样品：自制展开剂：CHCl3-(CH3)2CO1:1,展开前氨水饱和15分钟。显色剂：改良Dragendroff试剂2.定性反应取抽松物溶于稀（0.5％）HCl中，分置4支试管中，加下列试剂1～3滴，观察现象。(1)碘－碘化钾试剂(2)硅钨酸试剂(3)碘化铋钾试剂(4)苦味酸试剂3.衍生物的制备汉防己碱二碘甲烷盐（汉肌松）的制备取丙酮结晶过的甲、乙素混合物50mg，加MeOH5ml溶解，用10%KOH甲醇溶液调pH11，再加入碘甲烷0.5ml，回流加热15min，回收甲醇至干，残留物以乙醇重结晶，可得到白色结晶，即汉肌松，mp261.5℃六、实验安排本实验共分4次完成。第一次：总生物碱的提取第二次：亲脂性生物碱与水溶性生物碱的分离；季铵型生物碱的分离纯化（碱水层酸化，雷氏铵盐沉淀，滤取沉淀干燥）第三次：季铵型生物碱的分离纯化第四次：汉防己甲素和乙素的柱层析分离；鉴识七、思考题1.减压回收较常压回收有那些特点？影响减压回收速度的关键是什么？如何控制？停止