电泳和电色谱演示文稿

电泳和电色谱演示文稿当前第1页\共有87页\编于星期六\11点优选电泳和电色谱当前第2页\共有87页\编于星期六\11点电泳的基本原理

带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。生物分子都带电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异。因此，在一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。当前第3页\共有87页\编于星期六\11点在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（X）的乘积。F＝QX

质点的前移同样要受到阻力（f

）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：f

＝6πrην（r为质点半径，η为介质粘滞系数，ν为质点移动速度）当前第4页\共有87页\编于星期六\11点当质点在电场中作稳定运动时：F＝f即：QX＝6πrην

迁移率u：单位电场强度下的电泳速度，粒子的迁移率在一定条件下决定于粒子本身的性质即其所带电荷及大小和形状。u＝v/E=q/6πrη

v=QX/6πrη

当前第5页\共有87页\编于星期六\11点在具体实验中，移动速度V为单位时间t（单位为s）内移动的距离d（单位为cm），即V＝d/t。电场强度X为单位距离L（单位为cm）内电势差E（单位为伏特），即X＝E/L。将这两个公式代入上述公式，得到U=v/X=dL/Etd=u*Et/L由此可以得到两种物质移动距离的差为△

d=(dA-dB)=(uA-uB)Et/L从这个公式可以看出物质能否进行分离决定于二者的迁移率。

当前第6页\共有87页\编于星期六\11点实际过程中影响电泳迁移率的因素很多，可以分为以下三大类：(1)与被动离子(或粒子)本身的特性有关

(2)环境因素

(3)所加电场的特性这些因素在实验过程中要充分注意，尽量保持条件恒定不变，以便获得可重复的结果。当前第7页\共有87页\编于星期六\11点分类按支持介质的不同可分为：

⑴纸电泳（Paperelectrophorisis）

⑵醋酸纤维薄膜电泳（CelluloseAcetateelectrophoresis）

⑶琼脂凝胶电泳（AgarGelelectrophoresis）⑷聚丙烯酰胺凝胶电泳（PolyacrylamideGelelectrophoresis）（PAGE）

⑸SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。按支持介质形状不同可分为：⑴薄层电泳；

⑵板电泳；

⑶柱电泳当前第8页\共有87页\编于星期六\11点分类区带电泳不同的离子在均一的缓冲液体系中分离形成独立的区带。等速电泳区带相随分成清晰的界面，等速移动。等电聚焦影响因素电荷，电场强度（强，快），溶液pH，离子强度（高，慢），电渗现象（区别分析），支持物（均匀，吸附力小），温度（高，快，扩散也快）当前第9页\共有87页\编于星期六\11点区带电泳区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。当前第10页\共有87页\编于星期六\11点Electrophoresis(电泳)——NucleicacidsDNA&RNA的分离琼脂糖凝胶电泳EB(溴化乙啶)或Goldenview染色当前第11页\共有87页\编于星期六\11点蛋白质分离SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)考马斯亮蓝染色蛋白质电泳当前第12页\共有87页\编于星期六\11点聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理:分子筛(区别于过滤的分子筛)+电荷效应聚丙烯酰胺凝胶的优点：1.样品不易扩散；2.控制凝胶浓度形成不同孔径；3.不产生电渗，化学惰性；4.制成的多聚物再现性高，重现性好；5.机械强度好，6.需要设备简单，时间短。当前第13页\共有87页\编于星期六\11点SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样（约为18Å，即1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭园棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或单个肽链，因此测定的结果只是亚基或单条肽链的分子量。当前第14页\共有87页\编于星期六\11点SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和扩张强度都有所增加，并形成SDS蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”比率的增加而变小，比率接近1：20时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29配制，试验表明它能分离大小相差只有3%的蛋白质。凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。

当前第15页\共有87页\编于星期六\11点蛋白质样品用SDS处理后亚基的解聚和分子形状的改变当前第16页\共有87页\编于星期六\11点未知蛋白质分子量的测定基于上述SDS的原理介绍，我们可以利用SDS电泳进行未知蛋白质的分子量测定；当前第17页\共有87页\编于星期六\11点实验过程1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备2个干净的锥形瓶.

2.把玻璃板在灌胶支架上固定好.

※固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板.

当前第18页\共有87页\编于星期六\11点3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟.

※凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.

※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并隔绝空气

※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面.

当前第19页\共有87页\编于星期六\11点当前第20页\共有87页\编于星期六\11点4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟.

※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平.

5.在上槽内加入缓冲液后,拔出样梳。

※要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.

当前第21页\共有87页\编于星期六\11点当前第22页\共有87页\编于星期六\11点实验过程6、加样（1）取10µl标准蛋白溶解液于EP管内，再加入10µl2倍样品缓冲液，上样量为10µl。

（2）取10µl样品溶液，再加入10µl2倍样品缓冲液，上样量分别为5µl和3µl。

7.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在

沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。

※注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散.

※为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样当前第23页\共有87页\编于星期六\11点当前第24页\共有87页\编于星期六\11点8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。

当前第25页\共有87页\编于星期六\11点当前第26页\共有87页\编于星期六\11点9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。

※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分当前第27页\共有87页\编于星期六\11点当前第28页\共有87页\编于星期六\11点电泳后的凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后的凝胶照片

11.结果处理量出各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR:相对迁移率mR=

蛋白质样品距加样端迁移距离(cm)溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)当前第29页\共有87页\编于星期六\11点SDS电泳常见问题分析1.配胶缓冲液系统对电泳的影响？

在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。

当前第30页\共有87页\编于星期六\11点2.样品如何处理？

根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。

1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。

2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。

3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

当前第31页\共有87页\编于星期六\11点3.SDS电泳凝胶中各主要成分的作用？

聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；

制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

4.提高SDS电泳分辨率的途径？

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

当前第32页\共有87页\编于星期六\11点5.“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？

主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。

处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

6.“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？

主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。7.为什么带出现拖尾现象？

主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。8.为什么带出现纹理现象？

主要是样品不溶性颗粒引起的。

处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。当前第33页\共有87页\编于星期六\11点9.什么是“鬼带”，如何处理？

“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却与目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。

处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。10.为什么溴酚蓝不能起到指示作用？

我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。

处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。11.为什么电泳的条带很粗？

电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。

处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；

当前第34页\共有87页\编于星期六\11点12.为什么电泳电压很高而电流却很低呢？

这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。

处理办法：电泳槽正确装配即可。

13.浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？

这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。

14.凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？

通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，AP剂量不够或者失效。AP应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是AP和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。

15.电泳时间比正常要长？

可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。

当前第35页\共有87页\编于星期六\11点等电聚焦电泳

NH3++OH－

NH3++OH－

NH2

PPPCOOH＋H＋

COO－＋H＋

COO－蛋白质的阳离子蛋白质的兼性离子蛋白质的阴离子

当前第36页\共有87页\编于星期六\11点当前第37页\共有87页\编于星期六\11点两性电解质的种类(1)Ampholine(瑞典LKB)安福灵它是由许多脂肪族的多氨基,多羧基的异构体和同系物组成的,pH范围，4-6.5，5-8，3.5-9.5.当前第38页\共有87页\编于星期六\11点(2)Servalyte(德国Serva公司)它是在由丙烯基乙胺与乙烯基亚胺缩合并蒸馏得到的多胺混合物中,再引入磺酸基团或磷酸基团合成的.pH范围:2-4,3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、9-11、2-11、3-10.当前第39页\共有87页\编于星期六\11点(3)Pharmalyte(瑞典Pharmacia)七氨基多羧基组成的pH范围:2.5-5,4-5.5,5-8,8-10,3-10等当前第40页\共有87页\编于星期六\11点(4)载体两性电解质(军事医学科学院)合成的方式与Ampholine基本相同.pH范围当前第41页\共有87页\编于星期六\11点等电聚焦电泳（IFE）

利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下沿电场方向在凝胶内制造一个pH梯度。每种蛋白质都将迁移至与它的pI相一致的pH处。凝胶中加有两性电解质溶液（pH9-3）

加电场后在凝胶内形成一个稳定pH梯度

加样品，然后继续电泳凝胶染色表明样品按照各自pI值沿着pH梯度分布当前第42页\共有87页\编于星期六\11点等电聚焦电泳进行过程中等电聚焦电泳结束后（＋）（＋）（－）（－）高pH高pH低pH低pH当前第43页\共有87页\编于星期六\11点操作步骤及注意要点

凝胶配制：

a取10×0.5cm内径的玻璃管，从一端量出7cm作好标记，用橡皮片封底（用两条橡皮圈扎紧），垂直放置。

b

配制凝胶液（按顺序，每加一种试剂后都要轻轻充分摇匀，TEMED最后才加入，加入摇匀后要立即灌胶），用长滴管吸取配好的凝胶液，沿玻璃管注入至7ml标记平面，缓缓注入，避免产生气泡。

c立即用5ml注射器配针头注入约0.5cm高的蒸馏水，垂直放置（将长滴管及时清洗）

注意：丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。当前第44页\共有87页\编于星期六\11点

电泳将已聚合的凝胶去除水层，垂直插入电泳槽的橡皮管中，注意不要漏液。上槽注入5%H3PO4，下槽注入2%NaOH，检查凝胶管上下口内有无气泡，如有必须排除。上槽接正极，下槽接负极，50V预电泳30min，然后将电压维持在250V，电泳2小时。剥胶

用带有针头的注射器吸入蒸馏水，将针头插入凝胶与水之间，使针头慢慢螺旋前进。靠水流压力将胶与玻璃管分开，最后可用吸耳球在一端轻轻施压，将其取下。测量样品pI

直接用pH试纸插入所需测定的蛋白区带中测量当前第45页\共有87页\编于星期六\11点二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D―PAGE）二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋白质的大小进行分离）。这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。

当前第46页\共有87页\编于星期六\11点大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片当前第47页\共有87页\编于星期六\11点

双向电泳第一向：等电聚焦电泳第二向：SDS

双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维分布图：水平方向反映出蛋白在pI上的差异，垂直方向反映出它们在分子量上的差别。第一向电泳：等电聚焦电泳聚焦后凝胶放置在SDS凝胶上，进行第二向电泳第二向电泳：SDS分子量大分子量小pH9pH3pH9pH3当前第48页\共有87页\编于星期六\11点第一维电泳是等电聚焦，在细管中（φ1～3mm）中加入含有两性电解质、8M的脲以及非离子型去污剂的聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦，变性的蛋白质根据其等电点的不同进行分离。而后将凝胶从管中取出，用含有SDS的缓冲液处理30min，使SDS与蛋白质充分结合。将处理过的凝胶条放在SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的琼脂糖溶液使其固定并与浓缩胶连接。

当前第49页\共有87页\编于星期六\11点在第二维电泳过程中，结合SDS的蛋白质从等电聚焦凝胶中进入SDS－聚丙烯酰胺凝胶，在浓缩胶中被浓缩，在分离胶中依据其分子量大小被分离。这样各个蛋白质根据等电点和分子量的不同而被分离、分布在二维图谱上。当前第50页\共有87页\编于星期六\11点细胞提取液的二维电泳可以分辨出1000～2000个蛋白质，有些报道可以分辨出5000～10000个斑点，这与细胞中可能存在的蛋白质数量接近。由于二维电泳具有很高的分辨率，它可以直接从细胞提取液中检测某个蛋白。例如将某个蛋白质的mRNA转入到青蛙的卵母细胞中，通过对转入和未转入细胞的提取液的二维电泳图谱的比较，转入mRNA的细胞提取液的二维电泳图谱中应存在一个特殊的蛋白质斑点，这样就可以直接检测mRNA的翻译结果。当前第51页\共有87页\编于星期六\11点双向电泳分析中的样品制备制备原则：应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。当前第52页\共有87页\编于星期六\11点电泳

electrophoresis是指溶液中带电粒子在电场作用下发生迁移的电动现象。毛细管电泳

capillaryelectrophoresis

是利用被分析离子在电场作用下移动的速率不同而达到分离的目的，这种技术主要用来分析在毛细管缓冲溶液中能离解为离子的物质。毛细管电色谱

可以分离离子和中性分子。它是利用缓冲溶液的电渗流作为泵，使被分析的分子通过对其具有不同保留程度的第二相，达到分离的目的。毛细管电泳当前第53页\共有87页\编于星期六\11点毛细管电泳的基本原理电泳分离的基础

=eE

为离子移动的速度

e为电泳迁移率E为毛细管柱进样端至检测窗口间电场强度。离子的电泳迁移率不同，在电场中移动的速度不一样，利用这个原理可以把不同的离子彼此分离。电泳迁移率与分析物质所带电荷呈正比，与摩擦阻力系数呈反比。如果两种物质带有不同的电荷或者通过缓冲溶液移动的摩擦力不同，那么这两种物质可以彼此分离。电荷-尺寸只有一个相！！！当前第54页\共有87页\编于星期六\11点毛细管电泳1

离子移动的速率

=eE=eU/LU是毛细管柱两端施加的压力L是毛细管柱总长。采用高电压可以达到使离子迅速移动和快速分离。2

毛细管电泳中的板高N=eU/2D由于分离度随塔板数的增加而增加，因此为了获得高的分离度应采用高电压。在凝胶板形电泳中，一般最高使用的电压约为500V。在毛细管电泳中，一般可采用20,000~60,000V的高电压。当前第55页\共有87页\编于星期六\11点3

电渗流在电泳过程中还存在另一种电动现象，即电渗。当高电压通过含有缓冲溶液的毛细管柱时，管内的溶质向阴极或阳极移动，产生电渗流。在柱内层氧化硅与溶质的界面上形成双电层是电渗流产生的原因。在典型的毛细管电泳分离中，若有电渗存在，离子的洗脱顺序是:首先是最快的阳离子，紧接着是依次减慢的阳离子，然后是全部的中性分子在一个区域出现，最后是最慢的阴离子，紧接着的是依次加快的阴离子。当前第56页\共有87页\编于星期六\11点毛细管电泳的分离模式与应用细管区带电泳capillaryzoneelectrophoresis,CZE毛细管凝胶电泳capillarygelelectrophoresis,CGE毛细管等速电泳capillaryisota-chophoresis,CITP毛细管等电聚焦capillaryisoelectricfocus,CIEF当前第57页\共有87页\编于星期六\11点细管区带电泳是基于试样中各个组分间荷质比的差异进行分离的。这种电泳模式的特征是整个系统都用同一种缓冲溶液充满。背景电解质的浓度一般高于试样，起运载电流的作用，其离子有一定的迁移率。当电流通过时，缓冲溶液中的阴，阳离子分别以一特定的速度分别向正极和负极移动。同时试样中的不同离子将按各自的恒定速度移动，形成背景电解质离子流动中伴随有试样离子的流动。如果试样中不同离子的迁移率差别很大，就能将不同离子分离。毛细管区带电泳可以分离小离子，而且能分离那些衍生化或反应生成离子的物质，如抗炎药物，氨基酸，蛋白质等物质。当前第58页\共有87页\编于星期六\11点毛细管凝胶电泳是将生物大分子如蛋白质，DNA片断，按相对分子质量大小进行分离的一种分离方法。毛细管凝胶电泳一般是在多孔的凝胶基质上进行，如聚酰胺聚合物。在凝胶的孔穴中含有缓冲混合物，分离是在穴中进行。最常用的凝胶是在交联剂的存在下聚合丙烯酸酰胺。聚合物的孔穴大小取决于单体与交联剂的比例，增加交联剂的量可以得到小孔穴凝胶。当前第59页\共有87页\编于星期六\11点毛细管等速电泳是基于试样中各组分电泳迁移率的差异而进行分离的。在等速电泳中试样是引入在两种不同的电解质之间，其中一种是迁移率较高的前导离子电解质溶液另一种是迁移率较低的尾随离子电解质溶液。当加上电场后，由于各种离子迁移率不同，向正极迁移的速度不同，故电解质溶液将形成由负极到正极增加的离子浓度梯度，而电位梯度与电导率呈反比，故低浓度离子区即低电导区有较高的电位梯度。因此电泳池内电解质溶液的电位梯度有正极向负极增加。由于离子的迁移速度与电场强度呈正比，随着电泳的进行，离子进入等速状态，此时形成紧紧相邻而又彼此完全分离的单组分区带。当前第60页\共有87页\编于星期六\11点毛细管等电聚焦是基于不同蛋白质或多肽之间等电点pH的差异进行分离。分子中既有酸性基团又有碱性基团的两性物质，如蛋白质，有一个等电点pI,即电荷为零时的pH。当溶液中的pH正好是两性物质的等电点时，它们在电场中不移动。高于此pH时，它们失去质子带负电荷，在电场作用下向正极移动低于此pH时，移向负极。若在毛细管柱中置一pH梯度缓冲溶液，从一端向另一端递增。当两性物质，如蛋白质进入毛细管柱置于高于它的pI的地方，它就带负电荷，趋向正极而朝这个方向pH逐渐变小，最后达到pH等于它的pI值的部位，此时净电荷为零，速度也为零。通过等电点聚焦，将试样中不同物质浓缩在不同的等电点处，从而达到分离的目的。当前第61页\共有87页\编于星期六\11点毛细管电色谱填充柱毛细管电色谱。基于填充柱的电色谱是各种电泳中最新出现的一种技术。它是利用电渗透驱动极性溶剂通过反相高效液相色谱毛细管柱，利用试样在两相的分配进行分离。胶束电动毛细管色谱。是在缓冲溶液中加入浓度高于胶束临界浓度的表面活性剂。胶束相在分离中起到了准固定相的作用，电中性的有机化合物按照它们在水相和有机相之间分配系数的差异进行分离。该方法也可用来改善带电有机化合物的分离选择性。当前第62页\共有87页\编于星期六\11点毛细管电动色谱的优点像高效液相色谱，能够分离不带电荷的物质。像毛细管电泳法，不需要压力泵系统的情况下，提供了微量体积试样溶液的高效分离通过电渗流泵，而不是通过机械输送流动相通过固定相的。明显地简化了输送体系。电渗泵产生的是塞子式流动轮廓，而不是流体动力学轮廓，因此毛细管电色谱的分离柱效比高效液相色谱法高。当前第63页\共有87页\编于星期六\11点

毛细管电色谱CEC:以电渗流驱动流动相，开管和填充两种比高效液相色谱具有更高的柱效

当前第64页\共有87页\编于星期六\11点高效毛细管电泳仪器（1）当前第65页\共有87页\编于星期六\11点高效毛细管电泳仪器（2）当前第66页\共有87页\编于星期六\11点高效毛细管电泳仪器（3）当前第67页\共有87页\编于星期六\11点

一、高效毛细管电泳基本原理

在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同可实现分离。1.经典电泳分离法的不足所用分离柱的柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于HPLC），温度影响大。高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进。当前第68页\共有87页\编于星期六\11点2.高效毛细管电泳技术上的重要突破高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：

一是采用了0.05mm内径的毛细管,；二是采用了高达数千伏的电压。毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。当前第69页\共有87页\编于星期六\11点3.电泳现象与电渗流现象

电泳现象：带电离子在电场作用下的迁移，速度ν电泳

电渗流现象：玻璃表面存在硅羟基,pH>3时,形成双电层，在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动，速度ν电渗流。当前第70页\共有87页\编于星期六\11点4.分离过程

电场作用下，柱中出现：电泳现象和电渗流现象。

带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流两种速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反，ν电渗流>ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。当前第71页\共有87页\编于星期六\11点5.分离类型八种分离类型(1)毛细管区带电泳（CZE）最普遍、最基本的一种分离模式。(2)毛细管凝胶电泳（CGE）将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、DNA等。当前第72页\共有87页\编于星期六\11点(3)毛细管胶束电动色谱（MECC）

在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。由于电泳流和电渗流的方向相反，且ν电渗流

>ν电泳，则带负电的胶束以较慢的速度向负极方向移动，中性试样分子在胶束相和溶液（水相）两相间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长。可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。当前第73页\共有87页\编于星期六\11点二、仪器装置一般在一根长40~100cm,内径10~100m的毛细管柱中充入缓冲溶液，柱的两端置于两个缓冲池中。在两个缓冲池之间的毛细管接有两个铂电极。试样从一端进入，而检测器则在另一端。使用的高电压可以反相，以能分析阴离子。当前第74页\共有87页\编于星期六\11点一般的进样方式是电动进样和压力进样。电动进样是将毛细管柱的一端及其相应端的电极从缓冲池中移出，放入试样杯中，然后在一准确时间范围内施加压力，使试样因离子移动和电渗流进入毛细管柱。压力进样是用压差使试样溶液进入毛细管。产生压差的办法可以采用在检测器端抽真空，或者通过提高试样端液面。当前第75页\共有87页\编于星期六\11点三、影响柱效的因素及改进方法热效应：焦耳热仍是影响柱效的主要因素。采用外部冷却的方法散热，择合适的电压和电解质也是提高柱效的有效途径。选择合适的电解质降低电阻，电流低于200微安，一般几十微安。电渗流控制：电渗流的大小和方向依赖于毛细管壁与溶液间电势的极性和大小。使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向，如添加NaCl和甲醇可降低电渗流；加入乙腈则可以增大电渗流。加入反转剂,则可以改变电渗流的方向。当前第76页\共有87页\编于星期六\11点四、主要特点和应用高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。高灵敏度：可检测出低至10-21mol/L浓度的物质。高分析速度：可