液相色谱的基础知识及应用详解演示文稿

液相色谱的基础知识及应用详解演示文稿当前第1页\共有54页\编于星期日\5点（优选）液相色谱的基础知识及应用当前第2页\共有54页\编于星期日\5点1液相色谱发展历史与分类1.1色谱的起源(1903)Chromatography色谱M.S.Tswett当前第3页\共有54页\编于星期日\5点IUPACdefinitionofchromatography(1993): Chromatographyisaphysicalmethodofseparationinwhichthecomponentstobeseparatedaredistributedbetweentwophases,oneofwhichisstationarywhiletheothermovesinadefinitedirection.固定相（stationaryphase）：在色谱分离中固定不动、对样品产生保留的一相。流动相（mobilephase）：带动样品向前移动的另一相。色谱法：是一种物理化学分离方法，它利用不同组分与两相（固定相和流动相）之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，样品在两相中做相对移动时，各组分在两相间进行多次平衡，使不同物质达到相互分离。1.2色谱的定义当前第4页\共有54页\编于星期日\5点1.3色谱的发展历程当前第5页\共有54页\编于星期日\5点当前第6页\共有54页\编于星期日\5点1.4色谱中的分离过程定性定量串联应用样品纯化成分分析分离当前第7页\共有54页\编于星期日\5点色谱中的分离过程咖啡流动相固定相利用混合物中各组份在不同的两相中溶解、分配、吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离当前第8页\共有54页\编于星期日\5点1.5色谱的分类按流动相的物态分:–气相色谱(GasChromatography,GC)：用气体作为流动相(又叫载气)–液相色谱(LiquidChromatography,LC)：用液体作为流动相(又叫洗脱剂)按固定相的形态分:–平面色谱纸色谱薄层色谱

–柱色谱按流动相和固定相的相对极性–正相色谱(NormalPhaseChromatography)

固定相的极性大于流动相–反相色谱(ReversedPhaseChromatography)

固定相的极性小于流动相当前第9页\共有54页\编于星期日\5点HPLC与

GC的应用差异当前第10页\共有54页\编于星期日\5点HPLC与

GC的应用差异挥发非挥发疏水性亲水性糖环氧化合物多氯联苯脂肪酸甲酯芳香酯C2/C5碳氢化合物无机离子氨基酸糖类衍生物香精油聚合物单体甘油三酸酯磷脂亚硝胺有机磷杀虫剂酒精多环芳烃芳族胺脂溶性维生素抗体天然食用色素类黄酮抗生素腈类抗氧化剂乙二醇脂肪酸磺胺类挥发性羧酸醛酮类甘草膦合成食用色素苯酚黄曲霉毒素酶糖醇当前第11页\共有54页\编于星期日\5点2.色谱方法基本原理色谱的主要理论热力学理论以相的平衡观点研究色谱过程

塔板理论为代表

(Martin&Synge)动力学理论以动力学观点研究各种动力学因素对色谱峰的影响

VanDeemter方程为代表MartinSynge当前第12页\共有54页\编于星期日\5点

分离的原理样品组分在固定相和流动相之间的分配

流动相带动样品经过色谱柱

不同组分与固定相之间相互作用的强度不同

不同组分在固定相上移动速度不同，

形成分离分配系数

KDXmXsKD1=[Xs]/[Xm]YmYsKD2=[Ys]/[Ym]

流动相固定相当前第13页\共有54页\编于星期日\5点

样品组分的分离进样、分配、移动、流出、分离KD2<KD1，所以Y先流出來当前第14页\共有54页\编于星期日\5点分配系数K分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时（Cs、Cm很小）时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。当前第15页\共有54页\编于星期日\5点样品组分分离情况A.样品与色谱柱固定相无任何作用

三种样品在

t0时间流出，

无保留无保留时间B.样品组分保留时间一致与色谱柱作用力相同

C.样品组分保留时间不一致

样品各组分与色谱柱作用力不同

D.实际分离状况高斯分布曲线当前第16页\共有54页\编于星期日\5点

色谱出峰形状实际出峰形状为高斯分布曲线(Gaussiancurve)样品的扩散效应无扩散样品扩散当前第17页\共有54页\编于星期日\5点

分离度

分离度（Resolution)两个相邻峰的分离程度。以两个组份保留值之差与其平均半峰宽值的比来表示：R=?时两峰认为已分开?当前第18页\共有54页\编于星期日\5点

不同分离度

R相邻两吸收峰分离度R=1.0,98%,

基线分离R=1.5,99.7%R＞=1.5時，完全分离（中国药典规定）两色谱峰被视为分开当前第19页\共有54页\编于星期日\5点

分离度R的数学表达分离度R的基本公式k’:容量因子(capacityfactor)反映吸收峰的保留特性:选择因子(selectivityfactor)反映相邻两色谱峰的分离程度

——色谱过程热力学因素N:理论塔板数，反映色谱柱的分离效率

(columnefficiency)——色谱过程动力学因素有关R=1/4Nxxk'1+k'-1柱效选择因子容量因子当前第20页\共有54页\编于星期日\5点

容量因子k’测量溶质在固定相和流动相中分布的摩尔数（量）之比

与温度有关(GC)与流动相溶剂种类及组成有关(LC)Injectiont0t’RtR当前第21页\共有54页\编于星期日\5点k’决定样品能进入色谱柱固定相的量k’太小，在固定相上保留太短，很快流出，难以确定保留时间

k’太大，在固定相上保留太强，洗脱时间太长，

理想的k’为1～5

当前第22页\共有54页\编于星期日\5点

分离效果与

k’值的最优化

k’值的优化改变溶剂成分、梯度条件

(洗脱强度)当前第23页\共有54页\编于星期日\5点

选择因子

色谱柱分开两组份的能力

＞1时两组分分离表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。t0t’R1t’R2Injection当前第24页\共有54页\编于星期日\5点选择因子

的影响因素影响

的因素

改变流动相成分，包括改变

pH

值改变柱温

(在LC不明显)改变固定相成分使用特殊化学效应当前第25页\共有54页\编于星期日\5点理论板数

N塔板理论热力学平衡理论色谱柱效的量化从分馏法技术衍生而来分离法依组分挥发性不同而分馏色谱法依组分分配系数不同而分离分配系数

K=Cs/Cm理论板数

N、塔板高度

H柱效随

N增大和

H减小而增加分配色谱流程模型N=L/H当前第26页\共有54页\编于星期日\5点理论塔板数N

与半峰宽W1/2和保留时间的关系如下在相同保留时间色谱峰越尖锐，则色谱柱效越高

当前第27页\共有54页\编于星期日\5点

分离效能的最优化增加容量增加选择因子增加柱效增加k’值可增加分离度但会增加分析时间改变流动相、固定相成分

增加值可增加分离度但不能因此影响

k’值当前第28页\共有54页\编于星期日\5点液相色谱仪设备概述当前第29页\共有54页\编于星期日\5点液相色谱仪器组成溶剂传输系统（泵系统）进样系统检测器工作站组分收集（选项）当前第30页\共有54页\编于星期日\5点液相色谱仪器结构组成示意图流动相储液瓶单元或多元泵梯度混合器预柱手动-进样器自动-进样器保护柱色谱柱柱后反应器柱温箱检测器馏分收集器积分仪工作站计算机接口温度控制单元样品制备单元当前第31页\共有54页\编于星期日\5点3.样品分析方法开发

当前第32页\共有54页\编于星期日\5点当前第33页\共有54页\编于星期日\5点样品预处理样品预处理的目的是为了纯化样品。完成纯化的方法有:稀释-

用一种互溶的且比流动相弱的溶剂或流动相本身稀释样品过滤-

有不同孔径的过滤材料.

提示:有的化合物可能吸附在过滤器上，从而影响定量.离心-

可除去样品中的颗粒物质.萃取-液液萃取，固相萃取挥发-采用惰性气体通过样品鼓泡或抽真空除去溶剂样品准备当前第34页\共有54页\编于星期日\5点优化概览优化应当是系统进行的，也就是说每个参数应当逐步变化.

!!每次运行只改变一个参数!!目标是在最短的分析时间内获得最好的分离结果.

优化溶剂强度

流速

温度

柱长

固定相*优化当前第35页\共有54页\编于星期日\5点流动相的选择流动相的选择原则是：①样品易溶，且溶解度尽可能大。②化学性质稳定，不损坏柱子。③不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。④粘度低，流动性好。⑤易于从其中回收样品。⑥无毒或低毒，易于操作。⑦易于制成高纯度，即色谱纯。⑧废液易处理，不污染环境。反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下：

H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是：正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇当前第36页\共有54页\编于星期日\5点系统方法开发)选择初始色谱柱(直径,长度,填料粒度）-4.6x250mm,5m使用适当的孔径初始运行采用与流动相组成条件一致的pH)优化k*(保留)梯度范围,时间,斜率流动相-很小变化)优化回收率样品的溶解性温度的作用键合相的作用有机改性剂)优化

*

(选择性)温度键合相pH(最后的手段))优化

N(色谱柱条件)流速长度填料粒度当前第37页\共有54页\编于星期日\5点分离度与k’,N,和的关系初始改变k'提高N提高a梯度范围,斜率流速,填料粒度,柱长温度、流动相、pH优化当前第38页\共有54页\编于星期日\5点色谱的定性分析色谱定性分析:

用保留值定性和色谱联用技术（如LC-MS、LC-FTIR)定性利用保留值定性基本依据：两个相同的物质在相同的色谱条件下应该有相同的保留值。但是，相反的结论却不成立，即在相同的色谱条件下，具有相同保留值的两个物质不一定是同一个物质利用已知物直接对照进行定性分析用绝对保留值定性－－一般要求用自动进样用相对保留值定性用已知物增加峰高法定性利用文献值对照进行定性分析－－采用保留指数(I)当前第39页\共有54页\编于星期日\5点检测器信号响应与时间的关系测量每个峰的保留时间tR1t0tR2timesignal当前第40页\共有54页\编于星期日\5点色谱的定量分析检测器信号响应与时间的关系测量每个峰的峰面积当前第41页\共有54页\编于星期日\5点定量分析的基本公式：

Mi–i组分的量；Ai–i组分的峰面积；fi–i组分的校正因子，与检测器的行为和被测组份的行为有关。定量分析的依据是被测组分的量与响应信号成正比，但相同含量的物质由于物理、化学性质的差别，即使在同一检测器上产生的信号也不同，直接用响应信号定量，必然导致较大误差。故引入校正因子。校正因子是定量计算公式中的比例常数，其物理意义是单位面积所代表的被测组分的量。

当前第42页\共有54页\编于星期日\5点1.面积百分法(AreaPercent)2.外标法(ExternalStandard)3.内标法(InternalStandard)4.归一化法(NormalizedPercent)色谱定量分析方法的种类当前第43页\共有54页\编于星期日\5点面积百分法

最简单的计算方法样品中的所有成分对检测器的响应值相同样品中的所有成分必须完全分离表示样品中单一组份相对于其他组份的含量

面积%=(AI/ΣA)*100AI=单一色谱峰的面积

ΣA=全部色谱峰的面积之和不要求进样量准确不适用于选择性检测器当前第44页\共有54页\编于星期日\5点归一化法(Normalized%)将样品中所有组份的含量之和定为100%。计算其中某一组份百分含量的定量方法：其中：xi－试样中组份I的百分含量

fi－组份I的校正因子

Ai－组份I的峰面积或峰高当前第45页\共有54页\编于星期日\5点归一化法示例

化合物 峰面积 校正因子 峰面积×校正因子 百分比含量C8 200 1.2 240 240/1708=14.1%C12 230 1.6 368 368/1708=21.5%C16 200 1.8 360 360/1708=21.1%C18 300 1.8 540 540/1708=31.6%C20 100 2.0 200

200/1708=11.7% 1030 1708 100%优点：方法简便，进样量与载气流速的影响不大缺点：样品中所有组份必须都能出峰，并且必须知道各自组份的校正因子（校正因子需要由已知的标准品来求得）。归一化法主要用于气相色谱的定量测定。且一般只适用于通用型检测器。当前第46页\共有54页\编于星期日\5点直接峰面积归一化－－无校正因子法%(NOCalibration)当样品中各组份的校正因子近似相等，如同系物或同分异构体，可直接用峰面积归一化进行定量。即简化为下式：示例：给出了采用校正因子和不用校正因子进行归一化法的定量结果组份乙苯对二甲苯间二甲苯邻二甲苯峰面积（Ai）校正因子（fi’）f’*Ai1200.97116751.00751400.961341050.98103校正因子归一化法定量结果直接峰面积归一化定量结果27.027.217.517.131.331.824.123.9当前第47页\共有54页\编于星期日\5点多点校正的定量分析单点校准峰面积进样量峰面积进样量响应值=样品量unn=峰面积响应值峰面积进样量多点校准当前第48页\共有54页\编于星期日\5点外标法（ExternalStandard)－又称校正曲线法在相同分析条件下，比较标准物质与样品的色谱峰面积或峰高1.用已