青霉素发酵综合性实验

发酵工艺学综合性实验：青霉素的发酵一、 目的与要求通过实验，以具体的青霉素发酵生产工艺流程为例，掌握发酵原理，掌握种子制备、发酵过程控制、与发酵相关参数的检测，掌握效价测定方法，为学生提供理论联系实际的机会。二、 材料和用品菌种：产黄青霉、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌仪器：灭菌锅、培养箱、超净工作台、大三角瓶、烘箱、水浴锅三、 实验内容（一） 、发酵过程控制培养基配制培养基的组成（%）：PDA培养基。培养基的分装及其灭菌将配好的培养基分装到250mL摇瓶中，每瓶100mL，最后将培养基置于121°C灭菌20min。3.接种将已经活化的斜面种子（产黄青霉）接种到摇瓶中30C摇床中培养。4.观察和取样观察发酵过程中是否存在异常情况，如发酵液颜色、气味等是否异常等情况。每12h取样一次，每次10mL左右。4.培养时间及镜检一般培养需要3-4d左右，然后利用镜检来检测发酵过程是否染菌。（二） 、发酵过程中生理生化指标的检测利用称重法测定生长曲线将每批次的样品（5-10mL）离心后称重，测得不同时间菌体的质量，以时间为横坐标，质量为纵坐标，得到曲线。测糖利用DNS法，测定每批次的样品（5-10mL）离心后的发酵液的还原糖的含量，以时间为横坐标，含量为纵坐标，得到曲线。（三）、青霉素效价测定（利用抑菌圈的实验方法测定青霉素效价）培养基配制LB培养基指示菌的培养选取指示菌金黄色葡萄球菌、枯草杆菌接种到灭过菌的液体培养基中，在30OC左右培养24-36h。抑菌试验步骤取0.2mL培养好的指示菌于平皿中，每种菌做2-3个平行样。用涂棒将指示菌在平皿中涂布均匀。用打孔器在涂布均匀的平皿中央打孔。取0.1mL不同时间取样的发酵液于孔中。最后将平皿放置于300C左右培养箱中培养并观察。四、实验结果分析绘制生长曲线（即十重-t曲线）。；绘制残糖变化曲线；绘制青霉素效价（透明圈直径表示）变化曲线测定菌体干重（3学时）一、 实验目的学会测定菌体干重的方法。二、 实验原理在不含固体的培养液中培养微生物，发酵液中的固体全市菌体，因此可以首先离心得到湿菌体后，用适当的方法干燥，得到干菌体的量可直接反映菌体生长的多少。三、 器材与试剂培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母膏10，NaCl5,pH7.2摇瓶装量20%。37°C摇床恒温培养10〜12h。分析测定仪器：恒温干燥箱，分析天平四、 测定菌体干重实验操作（1）将2个干燥的10ml离心试管放入95C烘箱烘2h取出，放入干燥器，待试管冷却后称重得到m空1,m空2（2） 在两试管中分别准确加入10ml发酵液，注意发酵液需摇匀。（3） 放入离心机离心，3000r/min，离心15min，注意：离心之前要将预离心的试管平衡并对称放入离心机，以免损坏离心机。（4） 同时测定该发酵液的A600值。离心毕，拿出试管，弃去上清液，将试管和其中的菌体放入95r烘箱烘干12h。取出试管，放入干燥器，待冷却后称重，得到m菌1，m菌2。（5） 数据记录记录：m空1，m空2,m菌1，m菌2,A600计算：m空均=（m空1+m空2）/2m菌均=（m菌1+m菌2）/2菌体干重=m菌均-m空均单位菌体干重=菌体十重X1000/10（g/L）菌体干重除以A600即得到二者的对应关系。在测定发酵过程的菌浓变化时，只要测得A600就可以计算出菌体干重。残糖（还原糖）检测一、 实验原理DNS为3.5二硝基水杨酸,还原糖（以葡萄糖计）与3.5二硝基水杨酸（DNS）反应，产生颜色变化,这种颜色变化与释放还原糖（以葡萄糖计）的量成正比关系，通过在550nm的光吸收值查对标准曲线（以葡萄糖为标准物）可以确定还原糖生产的量二、 试剂DNS试剂的配置方法：溶液A:称分析纯NaoH104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。将A、B溶液混合，加入1200ml水，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。四、实验操作1葡萄糖测定1mg/mL葡萄糖标准液小烧杯取分析纯葡萄糖置于烘干箱中烘干全，于分析天平中准确称取80°C烘至恒重的分析纯葡萄糖10mg,置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到10mL容量瓶中，用蒸馏水定容至10mL，混匀，4C冰箱中保存备用。3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂将6.3gDNS(分析天平中称取于小烧杯)和262mL2MNaOH溶液(大量筒称取250ml+小量筒称取12ml)，加到500mL(量杯量取)含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中(在微波炉中加热1min溶解)，再加5g结品酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。2.制作葡萄糖标准曲线取7支10mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。1mg/ml葡萄糖标准溶液蒸馏水DNS葡萄糖含量 光密度值管号 (ml) (ml) (ml) (mg/ml) (OD540)0010.75010.10.90.750.0120.20.80.750.0230.30.70.750.0340.40.60.750.0450.50.50.750.0560.60.40.750.06将各管摇匀，取试管架置于水浴锅中，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却全室温，用蒸馏水定容至10mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色(分光光度计预热20分钟)。调波长540nm，用0号管调零点，测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量(mg)为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。测定样品还原糖通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖的量。抗生素效价评定试验（3学时）一、 实验目的1、 熟悉体外抗菌试验操作技术。2、 掌握药物抗菌能力体外测定的常用方法及其用途。二、 实验原理常用的体外测定药物抑菌能力的方法有两大类：琼脂渗透法与浓度系列稀释法。琼脂渗透法时利用药物能够渗透至琼脂培养基的性能，将实验菌混入琼脂培养基后倾注成平板；或将试验菌均匀涂于琼脂平板的表面，然后用不同的方法将药物置于已含试验菌的琼脂平板上。根据加药的操作方法不同而有滤纸片法、打洞法、管碟法及挖沟法等。经适宜温度培养后观察药物的抑菌能力。浓度系列稀释法时把药物稀释成不同的系列浓度，混入培养基内，加入一定量的试验菌，经适宜温度培养后观察结果，求得药物的最低抑菌浓度（MIC）。三、 试验方法-滤纸片法（圆纸片扩散试验）［材料］无菌平皿1只，无菌1ml吸管1支，无菌小滤纸片，待检药（1个平板可做1种或多种药物实验），琼脂培养基（瓶装或定量分装15〜20ml于大试管，灭菌，备用），实验菌肉汤培养基，镊子，95%酒精等。［方法］琼脂培养基置于水浴中加热融化，冷却至50°C左右，用无菌操作法吸取菌液（制备每只平板约需0.1〜0.2ml）加入琼脂培养基中，迅速混匀，倾注于无菌平皿内，素转动平皿使细菌均匀分布其中，水平放置待凝（也可预先在平皿中铺一层琼脂培养基作底层