工业菌种地分离原则

工业菌种的分离原则:(1)根据发酵条件来筛选适应菌种(2)菌的生长温度应尽量高(3)菌对环境和设备的适应性和稳定性(4)菌种的生产效率和毒性，副产物等。菌种的筛选与分离:a施加选择压力：（1）控制培养基成分（2）控制培养条件（3）抑制不需要的菌类b利用菌种的生理活性特点菌种的纯种分离：（1）划线法：简单、快捷（2）稀释法：菌落单一均匀。固体培养基划线接种法稀释涂抹接种法生产性能的测定一般采用两步法：初筛：以量为主；复筛：以质为主菌种选择的总趋势：（1）野生菌→变异菌（2）自然选育→代谢控制育种（3）诱发基因突变→基因重组的定向育种菌株的选育菌种选育的理论基础：（1）微生物遗传的相对稳定和变异性。由于变异的存在，使获得新性状的菌种成为可能（2）遗传变异的根本原因是基因的改变：基因突变和基因重组菌种选育的方法菌种选育可分为自然选育、诱变育种、杂交育种、基因工程等方法。自然选育、诱变育种是利用基因突变来获得优良菌种。杂交育种、基因工程是通过DNA重组来获得优良菌种。自然选育概念：利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过筛除衰退型菌株，获得优良菌株的纯种选育的方法。可以纯化、复壮菌种，这是因为菌种在自发突变过程中，多数发生负向变异。为什么菌种多数倾向于发生负向变异？菌种退化和变异的原因总的来说：内因＋外因1.遗传基因型的分离要点：遗传物质的多样化，群体繁殖2.自发突变原因：1）沙土管长期保藏2)连续传代3）新陈代谢产生的诱变物质4）增变基因、死亡基因的存在3.经诱变剂处理后的退化变异优点：简单易行。缺点：效率低、进展慢(以微生物的自然变异作为基础的生产选种机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。)诱变育种：诱变育种是一种纯种选育方法.以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从变异体中找出产量高、性状优良的突变株的过程。物理诱变：包括各种射线照射，超声波，激光照射，离子流，失重等等物理因素的造成的菌种遗传物质的突变化学诱变剂:a.能和DNA相互作用，改变其结构，并引起遗传变异的化学物质;b.主要有碱基类似物、吖啶类、烷化剂(特点：高效、经济、但多数是强致癌物，应注意安全)生物诱变剂：噬菌体可用于抗噬菌体菌种的选育，其原理可能与诱发抗性突变有关菌种诱变育种的步骤:a.出发菌株的选择b.处理菌悬液的制备c.诱变处理d.中间培养e.分离和筛选出发菌株的选择:1.选择纯种2.平均发酵单位要高，且发酵单位的波动幅度不大，摇瓶间所测得结果的最高值和最低值之差要小。3.有良好的代谢特性4.选择对诱变剂敏感的菌株。5.选用多个出发菌株进行诱变收效较快。处理菌悬液的制备为什么要将菌株制成菌悬液来进行诱变？诱变剂的选择:a.野生型菌株(遗传性不稳定):用缓和的诱变剂。b遗传性稳定的菌株:先要用强烈的不常用的诱变谱广的诱变剂处理，使其发生强烈的变异，然后再用缓和的诱变剂进行处理或多次自然分离。c.要考虑诱变剂的作用机理和菌株的遗传背景、生理状态等来选择诱变剂，多种诱变剂复合使用效果好。d.最适剂量：一般杀菌率90%－99%较好，甚至99.9%，也有低至40-60%的突变菌株的筛选：直接摇瓶筛选法（工作量大，效率低）；琼脂块筛选法（简单、快速，但不准确）；半理性化筛选；自动化筛选（筛选几千个菌落数/天）；理性化筛选（rationalscreening）是运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以获得能大量形成发酵产物的高产突变株。

影响诱变效果的因素:a.出发菌株的遗传特性;b诱变剂;c.菌种的生理状态d.被处理菌株诱变前的预培养和诱变后的培养条件以及诱变处理时的外界条件

例如碱基类似物、亚硝基胍等只对分裂中的DNA有效，对静止的或休眠的孢子或细胞无效；而如紫外线、亚硝酸、烷化剂、电离辐射等能直接与DNA起反应，因此对静止的细胞也有诱变效应，但是对分裂中的细胞更有效。因此，放线菌、真菌的孢子在诱变前稍加萌发可以提高诱变率。

诱变处理前后的培养条件对诱变效果有明显的影响。可有意地于培养基中添加某些物质（如核酸碱基、咖啡因、氨基酸、氯化锂、重金属离子等等）来影响细胞对DNA损伤的修复作用，使之出现更多的差错，而达到提高诱变率的目的。例如菌种在紫外线处理前，在富有核酸碱基的培养基中培养，能增加其对紫外线的敏感。紫外线诱变处理后，将孢子液分离于富有氨基酸的培养基中，则有利于菌种发生突变。诱变育种的一些问题诱变手段的复合化与多样化（诱变的饱和）诱变强度的控制正向突变与反向突变变异菌株的筛选现代菌种选育技术;a.转化、转导、接合;b.杂交育种;c.原生质体融合技术;d.基因工程技术重组与杂交的关系：重组：分子水平，一般在体外;杂交（hybridization）：细胞水平杂交中必然包含着重组；重组则不限于杂交这一形式。一、常规的杂交育种(一)遗传标记:杂交育种所用的亲本菌株通常要有一定的遗传标记以便于筛选。如营养缺陷型、抗药性突变型等等，遗传标记的方法通常是将两个用来杂交的野生型菌株，经过诱变得到两株不同的遗传特性菌株作为杂交的直接亲本菌株。(二)异核体形成:例如完全培养基混合培养法。将两个直接亲本(营养缺陷型)的孢子混合接种于液体完全培养基中，培养l～2天，挑出生长的菌丝体，将菌丝取出，置于基本培养基平板上培养七天，长出的菌丝即为异核体。异核体是两个直接亲本菌株经过细胞间的接合而形成的，即在一条菌丝里含有两个遗传特性不同的细胞核，共同生活在均一的细胞质里，能够互补营养，因此能在基本培养基上生长。

(三)杂合二倍体的形成：杂合二倍体形成的方法是在基本培养基平板上分离异核体所产生的分生孢子，异核体的分生孢子里偶尔有两个遗传性状不同的细胞核发生了融合，这样就形成了杂合二倍核。这个杂合二倍核经过繁殖，就可以得到杂合二倍体。异核体自发形成杂合二倍体的频率较低，因此必须人为地提高形成杂合二倍体的频率。常用的方法有：提高异核体的培养温度，用紫外线照射异核体，用樟脑蒸气熏异核体菌丝等。杂交育种的优点：由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，因此，不论在方向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步。利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象，因此，是一种重要的育种手段。原生质体融合育种原生质体：动植物或微生物细胞去掉壁以后的内含物称原生质体。原生质体融合育种是基因重组育种的一种重要方法原生质体融合育种步骤：标记菌株的筛选和稳定性验证。原生质体制备。等量原生质体加聚乙二醇促进融合。涂布于再生培养基，再生出菌落。选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。生产性能筛选。原生质体融合育种的关键：（1）标记菌种的选择：a.获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或／和抗药性菌株。这里最重要的是标记必须稳定b.采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功，可以采用多标记菌种。（2）原生质体的制备:a.原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。b.在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。为什么要在高渗透压溶液中？影响原生质体制备的因素:a.菌体的前处理（为了使酶作用的效果好一些，可将菌作一些前处理。如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。）b.菌体的培养时间(为了使细胞易于原生质体化，一般选择增殖期的菌体)c.酶浓度（对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类要求不同，就是对酶的浓度也有差异。另外，最佳酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化）d.酶处理温度(20¡ª40℃)e.破壁时的pH值f.渗透压稳定剂(等渗透压稳定剂在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和KCl和NaCl等无机物)原生质体的融：PEG4000～6000，30-40%CaCl20.05mol/L原生质体的再生a.再生培养基：渗透压稳定剂＋各种营养成分；影响再生的因素：菌种，原生质体的制备过程，培养基成分等b.融合子的选择c.原生质体的诱变基因工程育种基因工程的定义：又称为重组DNA技术，是指按人们的科研或生产需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质（DNA片段），在体外切割，拼接形成重组DNA,然后将重组DNA与载体的遗传物质重新组合，再将其引入到没有该DNA的受体细胞中，进行复制和表达，生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。a.目的基因的获得b.载体系统的构建与选择c.基因与载体的连接d.转化宿主细胞e.重组子的筛选与鉴定菌种的衰退的原因：a.菌种保藏不当b.菌种生长条件没有得到满足c.菌种天生具有的变异性菌种的复壮：a.纯种分离b.通过寄主体进行复壮c.淘汰已衰退的个体菌种保藏:1.原理保证微生物的存活，生理活性降至最低。低温、干燥、缺氧、缺营养物质2.方法（1）斜面保藏法(2）沙土管保藏法（3）菌丝速冻保藏法（4）石蜡油封存法（5）冷冻干燥保藏法（6）超低温保藏法菌种保藏须注意如下三方面：（一）菌种在保藏前所处的状态:绝大多数微生物的菌种均保藏其休眠体，如孢子或芽胞。保藏用的孢子或芽胞等要采用新鲜斜面上生长丰满的培养物。菌种斜面的培养时间和培养温度影响其保藏质量。培养时间过短，保存时容易死亡，培养时间长，生产性能衰退。一般以稍低于生长最适温度培养至孢子成熟的菌种进行保存，效果较好。（二）菌种保藏所用的基质:斜面低温保藏所用培养基，碳源比例应少，营养成分贫乏比较好，否则易产生酸，或使代谢活动增强影响保藏时间。砂土管保藏需将砂和土充分洗净，以防其中含有过多的有机物，影响菌的代谢或经灭菌后产生一些有毒物质。冷冻干燥所用的保护剂，有不少经过加热就会分解或变质的物质，过度加热往往形成有毒物质，灭菌时应特别注意。（三）操作过程对细胞结构的损害:冷冻干燥时，冷冻速度缓慢易导致细胞内形成较大的冰晶，对细胞结构造成机械损伤。真空干燥程度也将影响细胞结构，加入保护剂就是为了尽量减轻冷冻干燥所引起的对细胞结构的破坏。细胞结构的损伤不仅使菌种保藏的死亡率增加，而且容易导致菌种变异，造成菌种性能衰退。发酵是具有生物属性的，以微生物为手段的生产方式微生物细胞能为其自身提供代谢能微生物细胞的生存方式与动物、植物等高等生物的细胞不同，微生物细胞能独立存在，自主生活。可塑性强，细胞水平的代谢调节能力超过高等生物。（高效，适应，可变）生化反应途径，代谢途径与代谢网络一系列按序进行的生物化学反应构成生化反应途径；若这条途径在活细胞里运行，则为代谢途径。代谢途径与跨膜输送系统按代谢规律汇成（物质）代谢网络。代谢网络的联网问题代谢中间化合物都在代谢网络上，有些有机化合物虽然不在代谢网络上但仍有可能与代谢网络“联网”。所谓“联网”就是用化学或生物化学反应把指定的化合物连接到代谢网络上去，从而使它与微生物的代谢建立联系。“联网”可以用化学或生物学方法（含DNA重组技术）来实现。广义的“联网”包含代谢网络细节不同的生命有机体之间接力赛式的代谢联系。已在“网”上或者可以“联网”的化合物都可能被开发为工业发酵的产物或原料。三羧酸循环的中间产物是许多物质合成的前体什么叫代谢流？由于微生物代谢网络所带来的代谢主流多向性和选择性问题。代谢流和碳架物质流代谢物在代谢网络中流动形成代谢流。广义的代谢流还包括能量流和信息流。在代谢分析和代谢工程中，代谢流往往首先是指有机物流（碳架物质流）。在一定的培养条件下，代谢物在代谢网络中流动，流量相对集中的代谢流叫做该培养条件下的代谢主流。代谢主流的流量测定是代谢工程的重要组成微生物自身的代谢调节，往往不利于人类的工业生产。因此，人们通过改变微生物遗传特性、控制生产过程中的各种条件等措施来实现对微生物代谢调节的人工控制，使微生物能最大限度地积累对人类有用的代谢产物。微生物代谢调节的机制酶合成的调节：诱导与反馈阻遏酶活性的调节：激活与反馈抑制（变构调节）微生物细胞内的酶可分为组成酶(微生物有些酶总是适量地存在,它们是不依赖于酶底物或底物的结构类似物的存在而合成的酶,如葡萄糖转化为丙酮酸过程中的各种酶)和诱导酶(适应性酶,是依赖于某种底物或底物的结构类似物的存在而合成的酶。诱导酶合成的基因以隐性状态存在于染色体中)

操纵子学说：基因表达和控制的一个完整单元，其中包括结构基因，调节基因，操作基因和启动基因。诱导型操纵子：效应物存在导致基因表达。阻遏型操纵子：效应物存在导致基因表达的关闭。代谢的分类分解代谢（异化作用）;合成代谢（同化作用）初级代谢可以为次级代谢产物合成提供前体物和为次级代谢产物合成提供所需要的能量，而次级代谢则是初级代谢在特定条件下的继续和发展。次级代谢产物的类型:1.根据产物合成途径可以分为五种类型：（1）与糖代谢有关的类型(2）与脂肪酸代谢有关的类型（3）与萜烯和甾体化合物有关的类型（4）与TCA环有关的类型（5）与氨基酸代谢有关的类型2，根据产物的作用区分类型:抗生素、激素、生物碱、毒素、色素及维生素等类型。次级代谢物的生物合成:1.养分的摄入2.通过中枢代谢途径转化为中间体3.前体的合成与修饰4.前体进入次级代谢产物合成途径，并最终形成产物前体的来源：前体大多数源自初级代谢途径的产物或中间体，所以，中间体的走向是前体合成的关键。当初级代谢和次级代谢具有共同的合成途径时，初级代谢的终产物过量，往往会抑制次级代谢的合成，这是因为这些终产物抑制了在次级代谢产物合成中重要的分叉中间体的合成。如赖氨酸和青霉素的生物合成过程中有共同中间体α-氨基己二酸，当培养液中赖氨酸过量时，则抑制α-氨基己二酸的合成，进而影响到青霉素的合成。次级代谢产物一般在菌体生长后期合成次级代谢产物发酵经历两个阶段，即营养增殖期和产物形成期。如在菌体活跃增殖阶段几乎不产生抗生素。待到细胞停止生长，进入到恒定期才开始活跃地合成抗生素，成为生产期。微生物次级代谢的调节思考题为什么次级代谢相关合成酶多是诱导酶？为什么初级代谢产物合成的酶专一性强，催化次级代谢产物合成的酶专一性不强？培养基是人工配制的供微生物或动植物细胞生长繁殖和合成各种代谢产物所需要的、一定比例的多种营养物质的混合物，同时培养基也为微生物等提供除营养外的其他生长所必须的环境条件。发酵培养基必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的碳源、氮源、无机元素、生长因子、水和氧气等。大规模发酵生产中还必须重视培养基原料的价格和来源。工业微生物发酵培养基应具有的特点:1、单位培养基能产生尽量多的产物2、目的产物的合成速度尽量快3、副产物尽量少4、质量稳定，价格低廉，易于长期获得5、尽量不影响发酵过程中的操作和产物的后处理等培养基成分A.碳源：培养基的主要成分之一，为微生物提供生长繁殖所需的能源，及合成菌体和目的产物的原料。1）碳水化合物：葡萄糖，乳糖，淀粉，糖蜜，糊精，玉米粉等。2）脂肪：比糖类释放更多能量，需要更多溶解氧。3）有机酸，烃和醇类等石油化工产品。糖蜜：制糖工业的副产品，是一种粘稠、黑褐色、呈半流动的液体，组成因制糖原料、加工条件的不同而有差异，其中主要含有大量可发酵糖(主要是蔗糖)，是很好的发酵原料。发酵培养基所用的碳源很多都是粮食和油料原料，所以节约用粮是发酵生产的重要环节，所以一方面要促进发酵的高产和转化率，一方面要从原料的节约和代用上着手，如改善培养基配比，开拓新的培养基资源，使用废弃资源代替粮食等。发酵碳源原料的前处理淀粉的前处理：淀粉多数情况下不能作为培养基直接利用，需将其水解为葡萄糖才能使用。制备方法：1.酸解法2.酶解法3.酸酶结合法糖蜜的前处理：糖蜜的浓度很大，杂质较多，发酵前需进行预处理，包括稀释、通风、酸化、澄清、灭菌等过程。B.氮源：构成菌体组分和含氮代谢物.1）有机氮源：黄豆饼粉，玉米浆，花生饼粉，蛋白胨，酵母膏，鱼粉等。有机氮源除了作为菌体生长繁殖的营养外，有的还是产物的前体，如缬氨酸可作为红霉素的前体。尿素也是常用的有机氮源，但成分单一，不具有其他有机氮源的特点。2）无机氮源：铵盐，硝酸盐和氨水等，微生物对无机氮源的利用非常快，所以也称为速效氮源，会导致分解代谢物阻遏。氨水是抗生素生产中常用的无机氮源，如合成1mol链霉素需要7mol的NH3，使用氨水要注意除菌。生理酸性物质和生理碱性物质硫酸铵：(NH4)2SO4硝酸钠：NaNO3可用于补充氮源并调节pH值。C.无机盐及微量元素无机盐是微生物活动不可缺少的物质。其主要功能是构成菌体成分、作为酶的组成部分、酶的激活剂或抑制剂、调节培养渗透压、调节pH值等。微生物对无机盐的需要量很少，但无机盐含量对菌体生长和产物的生成影响很大。磷酸盐：磷是某些蛋白质和核酸的组成成分。有利于糖代谢，可以促进菌体生长，但过量时会抑制产物合成。磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用。工业上常用K3PO4•3H2O、K3PO4和Na2HPO4•12H2O、NaH2PO4•2H2O等磷酸盐。镁：处于离子状态时，是许多重要的酶(己糖磷酸化酶，柠檬酸脱氢酶、羧化酶等）的激活剂；影响基质的氧化，蛋白质的合成，能提高一些氨基糖苷类抗生素产生菌对自身产生的抗生素的耐受能力，如卡那霉素、链霉素等。硫：对于蛋白质的活性和构成有重要作用。钠、钾、钙等与细胞渗透压和通透性有关，是许多酶的激活剂，促进糖代谢。铁：菌体有氧氧化的必须元素，铁制发酵罐可以提供。但青霉素产生菌对铁敏感，所以需对发酵罐预处理。Zn、Co、Mn、Cu等元素大部分作为酶的辅基和激活剂；一般作为碳、氮源的农副产品天然原料中，本身就含有某些微量元素，不必另加。D.生长因子从广义来说，凡是微生物不可缺少的微量有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称为生长因子。其功能是构成细胞的组成分，促进生命活动的进行。生长因子不是所有微生物都必需的，它只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物。有机氮源是生长因子的重要来源，如玉米浆中含有丰富的氨基酸，微量元素和生长素，是多数发酵产品的良好氮源。前体是指能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去的物质，其自身的结构并无太大变化，但产物的合成却能有较大提升，如玉米浆中