发酵工程韦革宏杨祥节

第五章发酵工程的灭菌与空气除菌——设备、基质和空气的净化当前第1页\共有69页\编于星期六\2点第一节常见灭菌方法——化学、辐射和热灭菌当前第2页\共有69页\编于星期六\2点概述灭菌的概念：灭菌

(sterilization)即“失去繁殖能力”的意思，是指采用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备中一切有生命的有机体的过程。与灭菌相近的几个概念灭菌与杀菌(除菌)杀菌：杀死微生物后，其躯壳仍存在。溶菌：杀死微生物并使其细胞躯壳溶解、消失。除菌：从体系中去除微生物细胞。比较当前第3页\共有69页\编于星期六\2点概述工业生产中常用的灭菌方法：化学灭菌射线灭菌干热灭菌湿热灭菌过滤介质除菌当前第4页\共有69页\编于星期六\2点一、化学灭菌概念：化学灭菌指用化学药品直接作用于微生物抑制其增殖或将其杀死的方法。灭菌剂：迅速杀死体系表面和内部所有微生物。消毒剂：只杀死体系(主要是表面)中的病原微生物。防腐剂：抑制体系(主要是食品)表面和内部微生物的生长繁殖。注意：抑菌和杀菌甚至溶菌作用是相对的。当前第5页\共有69页\编于星期六\2点一、化学灭菌常用的化学药剂主要有石碳酸、甲醛、氯化汞、碘酒、酒精高锰酸钾等。共同规律：杀菌强度有别，但在低浓度时都有促进微生物生长的刺激作用，在浓度升高后依次表现出制菌、杀菌和溶菌的现象。常见化学杀菌剂及其作用机制和应用范围在发酵工业上的应用不用于培养基灭菌当前第6页\共有69页\编于星期六\2点一、化学灭菌环境消毒：生产车间、无菌操作间器械即手表面消毒：接种器械、取样器械等使用方法浸泡、擦拭、添加、喷洒、气态熏蒸等当前第7页\共有69页\编于星期六\2点二、射线灭菌概念：射线灭菌是利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的射线进行灭菌的方法。几种放射性射线紫外线灭菌波长为253.7nm的紫外线杀菌作用最强。机理：破坏核酸、形成活性自由基。穿透力差，一般用于环境和物体表面灭菌。灭菌效果：与距离、时间、微生物等有关。当前第8页\共有69页\编于星期六\2点三、干热灭菌热灭菌的分类干热空气灭菌设备：电热干燥箱条件：160℃条件下保温1~2h。注意：灭菌物品用纸包扎或带有棉塞时不能超过170℃。使用：玻璃和金属器具。当前第9页\共有69页\编于星期六\2点四、湿热灭菌湿热灭菌是利用饱和水蒸汽冷凝时释放的大量穿透力极强的潜热使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子受到不可逆破坏的灭菌方法。条件：121℃维持20～30min。设备：各种高压蒸汽灭菌器应用：非常广泛，是发酵工业的主要灭菌手段。当前第10页\共有69页\编于星期六\2点第二节培养基与发酵设备的灭菌

——原理和工艺当前第11页\共有69页\编于星期六\2点一、湿热灭菌的基本原理微生物的耐热性温度与微生物生长的关系微生物热死原因体内的一些重要蛋白质发生凝固、变性。致死温度和致死时间能够杀死微生物细胞的某一最低温度称致死温度。在致死温度以上的某个温度杀死全部微生物细胞所需的时间称为致死时间。热灭菌效率的衡量——TDP、TDT、D值、z值和F值当前第12页\共有69页\编于星期六\2点一、湿热灭菌的基本原理微生物的热阻热阻指在某一特定条件下(主要是指温度和加热方式等)微生物细胞的致死时间，表征了不同微生物细胞对热的相对抵抗力。例如一些微生物的相对热阻和抵抗力如表5-1.微生物热死亡的数学规律微生物的热死亡规律符合对数规律。微生物的死亡速率(dN/dt)与任何一瞬时残存的活菌数成正比，称之为对数残留定律，用下式表示：当前第13页\共有69页\编于星期六\2点式中：N为培养基中残存的活菌数(个)；t为灭菌时间(s)；k为灭菌反应速度常数或称为菌比死亡速率(s-1),值的大小与灭菌温度和菌种特性有关；dN/dt为活菌数的瞬时变化速率，即死亡速率(个/s)。(5-1)当前第14页\共有69页\编于星期六\2点一、湿热灭菌的基本原理灭菌时间的确定将式5-1积分，有：式中：N0为灭菌开始时原有的菌数(个)；Nt为灭菌结束时残留的菌数(个)。(5-2)当前第15页\共有69页\编于星期六\2点一、湿热灭菌的基本原理影响灭菌时间的因素污染程度(N0)灭菌程度或要求(残留的活菌数Nt)灭菌反应速度常数k实际灭菌要求Nt常要求1/1000。热死速率常数k的判定可以把微生物热死过程看成一简单一级化学反应,热死速度即反应速度，活菌数即反应物，而热死速率常数即反应速率常数，则由Arrhenius定律有：当前第16页\共有69页\编于星期六\2点式中：A为比例常数，s-1；△E为活化能，J/mol；R为气体常数，8.314J/(mol·K)；T为绝对温度，K。k值与活化能的关系活化能处于指数项，可见其与k值的变化关系密切。

高温瞬时灭菌(HTST)营养损失小的原理，可以从细菌与一些营养物的不同活化能得到解释。(5-3)当前第17页\共有69页\编于星期六\2点一、湿热灭菌的基本原理k值与温度的关系式5-3可以变化为：

图5-2显示了这种关系。k随温度的升高而升高，同一温度下，随微生物种类(活化能)不同而不同。参见表5-5.杀灭细菌芽孢时间的估算与芽孢的种类和培养条件有关。(5-4)当前第18页\共有69页\编于星期六\2点一、湿热灭菌的基本原理可以根据Q10估算。表5-6a估算的芽孢不同温度大概灭菌时间表5-6b一些细菌芽孢的实际杀灭时间当前第19页\共有69页\编于星期六\2点二、培养基的灭菌（一）培养基的灭菌方法分批灭菌概念：又称为间歇灭菌，就是将配制好的培养基全部输入到发酵罐内或其它装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备加热至灭菌温度后维持一定时间，再冷却到接种温度。也称为实罐灭菌或实消。当前第20页\共有69页\编于星期六\2点二、培养基的灭菌过程：包括升温、保温和冷却等3个阶段。图5-4培养基分批灭菌过程中温度变化情况当前第21页\共有69页\编于星期六\2点二、培养基的灭菌操作步骤空气过滤器灭菌干燥打料，开搅拌开排气阀，开夹套(蛇管)预热至80~90℃同时从卸料管道进气至121℃三路进汽，四路出汽保温30min先后关闭排汽和进汽阀门，同时逐渐通入无菌空气夹套(蛇管)冷却至接种温度当前第22页\共有69页\编于星期六\2点图5-5分批灭菌的进汽、排汽及冷却水管路系统1.空气过滤器灭菌干燥2.打料，开搅拌3.开排气阀，开夹套(蛇管)预热至80~90℃4.同时从卸料管道进气至121℃5.三路进汽，四路出汽保温30min6.先后关闭排汽和进汽阀门，同时逐渐通入无菌空气7.夹套(蛇管)冷却至接种温度当前第23页\共有69页\编于星期六\2点二、培养基的灭菌分批灭菌的优点：设备、操作简单，适合小规模发酵分批灭菌的缺点：周期长、能耗大，营养成分破坏大连续灭菌概念：连续灭菌是将培养基通过专门设计的灭菌器，进行连续流动灭菌后，进入预先灭过菌的发酵罐中的灭菌方式，也称之为连消。特点：快速，营养成分破坏少灭菌流程见图5-5.当前第24页\共有69页\编于星期六\2点图5-6培养基连续灭菌的基本流程

关键点：培养基物料少而分散当前第25页\共有69页\编于星期六\2点二、培养基的灭菌固体培养基的灭菌特点：固体培养基一般为粒状、片状或粉状，流动性差，也不易翻动，加热吸水后成团状，热传递性能差，降温慢。灭菌方法：自制土蒸锅转鼓式灭菌器（见下页图）当前第26页\共有69页\编于星期六\2点图5-7某食用菌工厂的转鼓式灭菌器

当前第27页\共有69页\编于星期六\2点二、培养基的灭菌（二）影响培养基灭菌的因素培养基成分培养基中的油脂、糖类和蛋白质会增加微生物的耐热性。培养基中高浓度的盐类等会减弱微生物细胞的耐热性。例如：对大肠杆菌，热死环境水中10%糖液30%糖液热死条件65℃1min

70℃5min

70℃30min当前第28页\共有69页\编于星期六\2点二、培养基的灭菌培养基成分的颗粒度一般对小于1mm颗粒的培养基，可不必考虑颗粒对灭菌的影响，但对含有大颗粒和粗纤维的基质要考虑其结团的影响。培养基的pH值pH值<6.0，氢离子易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应促使其死亡。微生物细胞含水量水分含量低蛋白不易变性，灭菌效果差。当前第29页\共有69页\编于星期六\2点二、培养基的灭菌微生物性质与数量不同微生物种类耐热性有很大差距生理时期上对数期耐热性较差微生物数量越多耐热性越强耐热个体出现机会多传热和死角培养基中的天然成分含菌较多冷空气排除情况原理：冷空气阻碍蒸汽传热且减小分压当前第30页\共有69页\编于星期六\2点二、培养基的灭菌灭菌对象体积不论在实验室还是在生产车间，灭菌体积越大，灭菌时间越长。其他如上磅下磅速度，发酵罐内部构造(实消)，搅拌的力度等都会对培养基灭菌效果产生一定的影响。当前第31页\共有69页\编于星期六\2点二、培养基的灭菌（三）培养基灭菌时间的计算分批灭菌简化：不计升温与降温阶段所杀灭的菌数，实际时间较计算值略短。可以由式(5-2)求得。例5-1

某发酵罐内装培养基40m3，在121℃下进行分批灭菌。设每毫升培养基中含耐热芽孢杆菌为2×105个，121℃时的灭菌速度常数(5-2)当前第32页\共有69页\编于星期六\2点二、培养基的灭菌

为1.8min-1。求理论灭菌时间（即灭菌失败机率为0.001时所需要的灭菌时间）。解：N0=40×106×2×105=8×1012个

Nt=0.001个k=1.8min-1灭菌时间：若考虑升温阶段(一般100℃以上)的杀菌贡献，则关键是估算出在这一阶段的平均热死速率常数km，就可根据这段时间tp计算出实际初始菌当前第33页\共有69页\编于星期六\2点二、培养基的灭菌

量Np，进而求出实际所需保温时间t。在这里由于现在普遍采用迅速降温的措施，时间短，所以在计算时一般不考虑降温的杀菌贡献。若以芽孢为标准，则在计算热死速率常数k的式(5-4)中一般系数A可取1.34×1036s-1，△E可以取2.844×105J/mol，则该式化为式(5-5)。(5-4)(5-5)当前第34页\共有69页\编于星期六\2点二、培养基的灭菌利用式(5-5)可求得不同灭菌温度下的速度常数，再以图解积分法求出温度效应总和，即可求出km：则升温阶段结束时，培养基中残留菌数Np可从下式求得：(5-6)(5-7)当前第35页\共有69页\编于星期六\2点二、培养基的灭菌则保温所需时间为：利用式(5-8)就可以计算考虑升温阶段的情况下的实际保温时间。例5-2

在例5-1中，灭菌过程的升温阶段，培养基从100℃上升至121℃，共需15min，若升温阶段按3℃的梯度近似计算，求升温阶段结束时,培养基中的芽孢数和保温所需的时间。(5-8)当前第36页\共有69页\编于星期六\2点二、培养基的灭菌解：T1=373KT2=394K

由式(5-5)可以分别求得各个温度梯度下的热死速率常数：再由图解积分法

(梯形法)求得升温阶段总效应：

=(k1△T+k2△T+…k7△T)+(k2△T+k3△T+…k8△T)/2≈0.127K/sT/K373376379382385388391394/s-12.09×10-44.35×10-48.94×10-41.81×10-33.64×10-37.24×10-31.42×10-22.77×10-2k·△T6.27×10-413.05×10-426.82×10-45.43×10-310.92×10-321.72×10-34.26×10-28.31×10-2当前第37页\共有69页\编于星期六\2点二、培养基的灭菌则升温阶段平均热死速率常数km为：则升温阶段结束芽孢数Np为：则保温时间t为：(s-1)(个)当前第38页\共有69页\编于星期六\2点二、培养基的灭菌由此可见，考虑升温阶段的灭菌作用后，保温时间比不考虑的减少了14.9%。所以发酵罐体积越大，其分批灭菌的升温时间越长，升温阶段的对灭菌的贡献就越大，相应的保温时间就越短。(min)当前第39页\共有69页\编于星期六\2点二、培养基的灭菌连续灭菌连续灭菌的理论灭菌时间的计算仍可采用对数残留定律，如果忽略升温的灭菌作用，则灭菌保温的时间：式中：C0为单位体积培养基灭菌前的含菌数，个/mL；Ct

为单位体积培养基灭菌后的含菌数，个/mL。(5-9)当前第40页\共有69页\编于星期六\2点二、培养基的灭菌例5-3

若将例5-1中的培养基采用连续灭菌，灭菌温度为131℃，此温度下灭菌速度常数为15min-1，求灭菌所需的维持时间。解：C0=2×105个/mLCt=1/40×106×103=2.5×10-11个/mL

所以维持时间t为：可见时间大大缩短(由于反混，实际时间略长)。(min)当前第41页\共有69页\编于星期六\2点三、发酵设备的灭菌进行气密性检查后，发酵前需要对发酵罐及其附属设备、管线进行灭菌，即“空消”。发酵罐：0.1MPa30min空气过滤器：0.15MPa2h补料罐：根据培养基情况接种管线：0.4MPa1h消泡剂、酸、碱、电极、取样等其他管线：0.1MPa30min本节结束谢谢当前第42页\共有69页\编于星期六\2点灭菌Sterilization彻底杀灭或去除消毒Disinfection杀死病原菌防腐Antisepsis食品化疗Chemotherapy宿主体内杀死/抑制病原菌/所有微生物具体因素抑制杀灭或抑制与灭菌相关的几个概念当前第43页\共有69页\编于星期六\2点图5-1制菌、杀菌和溶菌的比较当前第44页\共有69页\编于星期六\2点表5-2常见化学杀菌剂及其作用机制和应用范围2,7-二溴-4-羟汞基荧光红双钠盐十二烷基二甲基苄基溴化铵（苯扎溴铵）十二烷基-二甲基-2-苯氧基-乙基溴化铵龙胆紫当前第45页\共有69页\编于星期六\2点放射性射线γ射线：由放射性同位素如60Co或137Cs产生。是一种高能电磁波，波长很短(0.001-0.0001nm)，穿透力强，射程远，危险性大，必须屏蔽(几个cm的铅板或几米厚的混凝土墙)。X射线：由x光机产生的高能电磁波。波长比γ射线长，一般小于10埃，射程略近，穿透力不及γ射线。有危险，应屏蔽(几毫米铅板)。β射线：由放射性同位素(如32P、35S等)衰变时放出来带负电荷的粒子。在空气中射程短，穿透力弱。在生物体内的电离作用较γ射线、x射线强。当前第46页\共有69页\编于星期六\2点放射性射线中子流：不带电的粒子流。辐射源为核反应堆、加速器或中子发生器，在原子核受到外来粒子的轰击时产生核反应，从原子核里释放出来，电离密度大，常常引起大的突变，可以用于辐射育种。α射线：穿透力弱而电离能力强，本质是氦的原子核，镭、铀等产生，在人体外部不构成危险。此外还有紫外线、激光等，其中γ射线和紫外线常用来进行表面灭菌。当前第47页\共有69页\编于星期六\2点湿热法干热法高压蒸汽灭菌蒸煮法连续式间歇式巴式法烘箱火焰热灭菌热灭菌方法的分类当前第48页\共有69页\编于星期六\2点当前第49页\共有69页\编于星期六\2点当前第50页\共有69页\编于星期六\2点当前第51页\共有69页\编于星期六\2点当前第52页\共有69页\编于星期六\2点嗜冷菌耐冷菌嗜温菌嗜热菌极端嗜热菌温度与微生物生长的关系当前第53页\共有69页\编于星期六\2点微生物营养细胞芽孢/孢子/芽体YeastMoldBacteriaVirus5minat50~60ΟC30minat62ΟC10minat60~70ΟC30minat60ΟC5minat70~80ΟC30minat80ΟC2toover800minat100ΟC0.5~30minat121ΟC微生物细胞的热死速度当前第54页\共有69页\编于星期六\2点热灭菌效率的衡量TDP---thermaldeathpoint

在10min内杀死某微生物试样的最低温度。TDT---thermaldeathtime在某特定温度和其它条件下，杀死一个试样中所有微生物的最短时间。theDvalue---decimalreductiontime在某特定温度和其它条件下，杀死一个试样中所有微生物的90％的最短时间。thezvalue---使D值下降到1/10所需要升高的温度。theFvalue---在某特定温度(121ΟC)和其它条件下，杀死微生物到特定数量级的时间。当前第55页\共有69页\编于星期六\2点当前第56页\共有69页\编于星期六\2点当前第57页\共有69页\编于星期六\2点例如：罐装食品的灭菌以杀灭肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)的芽孢为标准，以防止肉毒梭菌中毒(Botulism)。某批灭菌杀灭芽孢从1012到100（一个）。D121=0.204min在121ΟC完成灭菌共需D，min。如果肉毒梭菌芽孢的z值是10ΟC，则在111ΟC灭菌时需D，min。122.51224.5当前第58页\共有69页\编于星期六\2点表5-1某些微生物的相对热阻和对灭菌剂的相对抵抗力(与大肠杆菌比较)当前第59页\共有69页\编于星期六\2点1069×1051049×1049×1039×109×102910510311010290%90%热当前第60页\共有69页\编于星期六\2点表5-3某些细菌芽孢与一些维生素B族物质的活化能比较HTST的原理就在于，随着温度的升高，活化能大的反应速度变