高通量测序技术及其在农业上的应用

高通量测序技术及其在农业上的应用第一页，共二十九页，编辑于2023年，星期二一、高通量测序简介二、高通量测序平台的介绍三、高通量测序技术在农业上的应用第二页，共二十九页，编辑于2023年，星期二1.1什么是高通量测序技术高通量序技术（next-generationsequencing）是对传统Sanger法测序的一次革命性的改变，是一次可对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的高通量的测序技术，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。

一.高通量测序技术第三页，共二十九页，编辑于2023年，星期二1.2为什么要发展高通量测序技术快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一直具有十分重要的意义。对于每个生物体来说，基因组包含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基因组DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的复杂性和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要的角色。第四页，共二十九页，编辑于2023年，星期二1977年Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的测序方法。经过不断的开发和测试，进入21世纪后，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的第二代测序技术诞生了。第五页，共二十九页，编辑于2023年，星期二1.3高通量测序技术的特点速度快准确度高成本低覆盖度深产出巨大第六页，共二十九页，编辑于2023年，星期二二

高通量测序技术的原理高通量测序技术包括Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术。下面对三种高通量测序技术的原理和特点分别进行具体介绍。第七页，共二十九页，编辑于2023年，星期二454Pyrosequencing基于磁珠的焦磷酸测序：A磁珠制备设备B454测序仪C454测序原理第八页，共二十九页，编辑于2023年，星期二第九页，共二十九页，编辑于2023年，星期二第十页，共二十九页，编辑于2023年，星期二454测序流程与BaseCalling每次加入一种碱基然后再对荧光强度进行读取。碱基聚合反应产生焦磷酸ppi，ppi在硫化酶催化下生成ATP，ATP在荧光酶催化下激发荧光，荧光强度和焦磷酸的量成正比。第十一页，共二十九页，编辑于2023年，星期二454技术的主要缺点是无法准确测量同聚物(homopolymer)的长度。例如当待测序列中出现Poly(A)的情况下，测序反应中会一次加上多个T，而加入T的数目只能从荧光信号的强度来推测，有可能造成结果不准确。也正是因为这个原因，454技术主要的错误不是来自核苷酸的替换，而是来自插入或缺失。454技术最大的优势在于较长的读取长度，使得后继的序列拼接工作更加高效、准确。第十二页，共二十九页，编辑于2023年，星期二IlluminaSolexa简介桥式PCR边合成边测序可逆终止物HiSeq2000第十三页，共二十九页，编辑于2023年，星期二第十四页，共二十九页，编辑于2023年，星期二第十五页，共二十九页，编辑于2023年，星期二Solexa的特点与主要应用读长较短，100－150bp通量高，25G每天，120-150G每Run主要应用：RNA测序、表观遗传学研究第十六页，共二十九页，编辑于2023年，星期二ABISOLiD简介SOLiD

SequencingbyOligoLigation/DetectionOligo连接测序：通过连接酶连接，再对oligo上荧光基团进行检测SOLiD5500xl第十七页，共二十九页，编辑于2023年，星期二ABISOLiD测序前期制备A样品片段化磁珠连接B乳化PCR3‘末端修饰C磁珠富集转到测序玻片第十八页，共二十九页，编辑于2023年，星期二ABISOLiD测序原理测序流程依次加入五种引物进行五次测序。加入测序引物及加入oligo连接酶连接，激发荧光检测，循环一个流程，换一种引物再循环一个流程，五个流程结果叠加分析出序列。第十九页，共二十九页，编辑于2023年，星期二SOLiD的特点与主要应用读长较短，50-75bp精度高，可达Q40通量高，20-30G每天，1Run可达120G主要应用：基因组重测序、SNP检测等第二十页，共二十九页，编辑于2023年，星期二三种平台的技术差异平台454SolexaSOLiDPCR磁珠乳化PCR桥式PCR磁珠乳化PCR测序载体磁珠玻片玻片测序方式焦磷酸、荧光可逆终止物、荧光连接酶、荧光结果序列FastQFastQCSFastQ第二十一页，共二十九页，编辑于2023年，星期二三、高通量测序技术在农业上的应用目前，高通量测序技术已广泛应用于动植物全基因组测序、基因组重测序、转录组测序、小RNAs测序和表观基因组测序等方面。下面对高通量测序技术在农业研究中的一些具体应作以介绍。第二十二页，共二十九页，编辑于2023年，星期二3.1全基因组重测序全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。全基因组重测序的个体，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸多态性位点(SNP)、插入缺失位点(InDel，Insertion/Deletion)、结构变异位点(SV，StructureVariation)，通过生物信息学手段，分析不同个体基因组间的结构差异，同时完成注释。

第二十三页，共二十九页，编辑于2023年，星期二3.1.1利用重测序进行进化分析及SNP筛选

Lai等(2010)对6个玉米(Zeamays)骨干自交系进行了全基因组重测序，共发现

1273124个单核苷酸多态性位点(SNPs)，得到30178个1～6bp的插入缺失位点(InDels)，新发现的这些SNPs和InDels提供了1个高密度的全基因组标记信息，同时也鉴定出数百个基因获得与丢失变异(Presence/AbsenceVariations，PAVs)。第二十四页，共二十九页，编辑于2023年，星期二3.1.2利用重测序技术鉴定突变体突变基因Ashelford等(2011)对一个拟南芥突变体ebi－1的回交系进行基因组重测序，随后又通过对突变体的表达数据进行调查使得候选SNPs数目得以有效缩小，最终成功鉴定出1个在AtNFXL－2基因中引起ebi－1突变表型的SNPs位点该研究证实利用回交系材料可以降低遗传背景噪音，对其进行测序分析可有效减少候选SNPs数目。第二十五页，共二十九页，编辑于2023年，星期二3.2全基因组denovo测序

全基因组denovo测序也称为从头测序，是直接对某个物种进行基因组全测序，然后利用生物信息学方法对序列进行拼接和组装，得到完整的物种基因组序列、基因组测序对研究物种的基因组和功能基因信息、阐明物种的进化及其生长发育具有重要的意义。

Huang等(2009)完成的黄瓜(CucumissativusL.)全基因组测序是世界上第一个完成全基因组测序的蔬菜作物，该工作的完成对黄瓜及其他近缘物种的遗传、改良基础生物学研究等具有重要的意义。第二十六页，共二十九页，编辑于2023年，星期二3.3转录组测序研究

转录组是指特定组织或细胞在某一功能状态下转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和非

编码RNA。转录组测序是指通过新一代高通量测序技术对cDNA测序，利用统计相关reads数计算出不同mRNA的表达量，发现转录水平的SNP新的mRNA等，该技术可以从表达水平、等位基因特异性表达RNA编辑、含有重要信息的融合基因转录子差异剪接等方面展开相关研究。第二十七页，共二十九页，编辑于2023年，星期二Zhang等(2010)用8种不同水稻(OryzasativaL.)样品的不同组织于不同时期混合建库，通过转录组技术分析了栽培稻的第1张转录组图谱，结果在水稻8种组织样品中检测到大约27000个基因的表达和38000个转录单元，证实了约9000个基因发生可变