第八章基因工程与体外表达xymune

中南大学生物科学与技术学院分子生物学研究中心教案授课科目:医学分子生物学授课内容:基因工程与体外表达授课对象：医学七年制、八年制授课时数：6学时授课教师：曾海涛授课地点：授课时间：授课教材：医学分子生物学（21世纪高等院校教材）胡维新主编，北京：科学出版社，2007，第一版第八章基因工程与体外表达一、目的要求：掌握：常用克隆载体；基因克隆的基本过程；外源基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达的原理和方法。熟悉：限制性核酸内切酶和其他常用工具酶的概念和特点；定点诱变技术原理。了解：昆虫表达系统；酵母表达系统。二、讲授重点：基因克隆的基本过程。三、讲授难点：α－互补筛选；阳性转染细胞的筛选；定点诱变技术原理。颠四、寒教学胜方法同：见多媒侄体教两学带五、联教恭沿具够：赵多媒市体课突件再六、娘讲授城内容甚：筹第一辉节事担秃敢基因忆工程照中周的工考具酶妄戴一、挪限制梦性核充酸内复切酶危（r封es唐tr芒ic越ti词on仪e渐nz蒜ym沸e）英池查副傍骗达限制狂性核驱酸内鸣切酶营是基新因克鞋隆中萄最重日要的玩工具排酶，朱主要教从原渴核细费胞中拔提取司。它聚是一涌种核衣酸内侮切酶宅，能腰从双冷链D拣NA鸣内部煤特异适位点钱识别弹并且猜裂解池磷酸餐二酯矩键。丽1．骨限制磨性核猫酸内疏切酶购的分赔类哲蚀Ⅰ染型酶柄具有镇限制呢和D烦NA六修饰倒作用薄。这蝶种酶被在非寸特异穿性位慕点,盘通常宝在识很别位御点下销游1顷00驼到1臣0株00希bp愤处切蹦割D漏NA草。裙Ⅱ番型酶微能肆在D币NA设分子籍内部反的特雁异位惰点，庆识别联和切限割双心链D踏NA寄，其桂切割占位点导的序各列可题知、螺固定州。充Ⅲ连型酶趣与样Ⅰ份型酶迈一样杰，具纱有限粉制与瑞修饰咐活性吵，能笋在识氏别位稍点附遣近切脑割D完NA废，切倚割位饺点很井难预刊测。怕2．塔限制罗性内啊切酶身的命朝名暑笑Ec交oR拦Ⅰ歪灯柿E代域表E年sc腹he早ri罗ch舱ia堆属割腊塑豆脖崇晨辞些c访o代驾表c翅ol给i脖种香靠坝筹翼购底民谷R控代表存RY愤13偷株杏3．故限制徐性内越切酶伶的识盛别和暴切割嗓位点爱控芳通秀常是系4～即6个料碱基钞对、肤具有奸回文臣序列器（p不al屠in猾dr秃om鹊）的极DN扯A片睁段，赶大多呢数酶孝是错扔位切尺割双斯链D匀NA健，产稿生5奉ˊ功或3邮ˊ亚粘性煤末端薯（s唱ti键ck及y泥en滑d）讲。浅戚买如E锻co誉R私Ⅰ袍切割次后产腿生5遵ˊ蛋粘性瓜末端京.龄Ps走t愁Ⅰ途切割网后产冰生3俯ˊ骨粘性容末端他.立有一摸些酶匪沿对翅称轴继切断刺DN呀A，趣产生贵平端毅或钝浇端（割Bl蜓un促t惨en器d）冒,鼻如S雷ma纠Ⅰ肉.腔二、灾其他晴常用组的工搜具酶降1.网D冶NA论聚合别酶专Ⅰ瑞(贼DN抖A次po喉ly蚊me头ra鸟se继I件)厦猪辰梯有聚刻合酶右活性答,烟3桨ˊ→平5掠ˊ所核酸博外切岸酶活规性,见5哑ˊ→渡3凭ˊ举核酸州外切扬酶活愚性。墓炒盛2.汪D郊NA降聚合拢酶享Ⅰ画大片我段惹DN蕉A聚宰合酶烘Ⅰ俯大片储段(摇la短rg乖e劳fr发ag喉me额nt里o剧f扑DN夺A堤po尽ly及me殃ra先se皮I丸)为丛DN宴A聚巨合酶疼I用公枯草度杆菌辨蛋白妇酶(鲜su枪bt光il健is野in不)裂旦解后轻产生宫的大值片段聪，这向个片报段也荒称为集Kl罚en珠ow胳片段身（K阿le倡no疾w杀fr需ag捏me乖nt娘）。屿悼叼有5朽ˊ→垂3源ˊ蔬聚合疲酶活腹性,纵3狂ˊ→剃5岂ˊ量核酸乌外切批酶活典性,伟无南5算ˊ→框3淘ˊ势核酸询外切略酶活粪性依Kl伪en轮ow垫片段片的主坏要用椅途有还：拴(1筑)殖补齐渔双链炭DN昏A的挑3斯ˊ际末端准。砖(2跟)露通过元补齐弹3驳ˊ误端，拉使3悟ˊ捆末端刘标记溜。催(3概)境在c圣DN吴A克劣隆中码，第柴二股损链的枝合成莫。皇(4感)俩DN芹A序蚀列分视析。伪3.拦逆职转录猛酶（读re查ve获rs换e捎tr并an掀sc姨ri司pt级as竹e）沉蛮彻是馆一种乖RN栋A依终赖的沙DN秘A聚呼合酶玻，即肃以R这NA同为模朱板合塘成D耕NA哨，合义成时跃需要颤四种认脱氧律核苷卧酸及磁3船ˊ恰-O块H引贫物，挨合成掏方向维为5丰ˊ→工3岂ˊ粮延伸缝，无趁3最ˊ→雷5利ˊ拾外切风酶活犯性。光广泛舌用于宋以m见RN洁A为救模板祝合成蚊cD至NA赏，构龄建c挎DN盘A文负库。促革4.警T烈4帽DN求A连盏接酶修（T努4驴D潜NA榜l征ig裁as雷e）负同灶T4央D扯NA首连接壮酶催哭化双筹链D滋NA倍一端塔3恋ˊ江-O银H与烧另一疏双链冠DN较A的掠5高ˊ旗端磷耳酸根趁形成绢3灭ˊ→兴5具ˊ电磷酸辈二酯冬键，僵使具拉有相拉同粘晒性末假端或大平端清的D乌NA红两端讽连接鼓起来诱。食5.孝碱秤性磷抵酸酶劫（a模lk脱al凶in拒e宗ph弯os扯ph万at础as六e）缘殿毕能去俘除D杏NA苹或R若NA配5丛ˊ框端的骑磷酸凝根。响制备烈载体蒙时，宵用碱刘性磷思酸酶辟处理你后，枣可防垒止载菌体自泽身连川接，味提高数重组盆效率铅。晚6.酷末冤端脱乳氧核角苷酸急转移享酶窝赠观末端笛脱氧垃核苷挽酸转缸移酶胸（t锄er射mi炮na漠l秀de婆ox隶yn众uc涝le逆ot气id谎yl牵t识ra得ns往fe算ra劝se抗,于Td窝T）院，简浅称末丢端转兽移酶脉。它甩的作饿用是惜将脱播氧核跃苷酸棚加到狂DN胞A的老3泰ˊ冰-O叉H上治，主准要用骗于探码针标淋记；拥或者碎在载肤体和日待克熄隆的铅片段樱上形案成同切聚物岸尾，续以便成于进膊行连忙接。景第二瓜节齿宝编侵安榨基因铲克隆部的姜载体济堡瓜外源闭DN瓜A一驼般没泡有明奴显的扔遗传乎标志无，如踩果将蛙其直袖接导验入宿厌主细尽胞，维没有锹有效贵的方扬法将唯导入校了外捡源D泻NA顽片段罚的细特胞和授没有司导入蜻外源快DN骄A的李细胞依区分也开来畏。此励外，纹外源谁DN箱A导壁入宿娃主细裂胞后破，不筛能随恰宿主徐细胞款的繁土殖而解复制午，即顷没有已自主疾复制誓能力滑，达捕不到该使外浅源D闪NA委片段印扩增倦的目锯的。透如果搜要将述外源完DN拴A片页段导失入宿蛙主细犹胞进香行扩琴增或躬表达该，就吐需要普有一薄个能索在该糕宿主落细胞馆内进销行自福我复苗制和捉表达祥的载咸体(牺ve拌ct辽or寨)来药携带深。外冲源D运NA章片段畜与载狡体在技体外液连接植，构舰成重裙组分帐子，转然后坛导入莲宿主社细胞次，使液之进亭行扩币增或然表达裤。迁一、拣质粒植（p发la尺sm标id沫）币阔希质粒唤是存绍在于唯多数述细菌厕和某仍些真退核生淋物染峡色体蒜外的裤双链红环状已的D炉NA薪分子邪。洗冰修质粒生含有瞒复制淡起始粘点，汪此复暂制起摄始点劈与其猴他一虾些顺惭式调划控因客子构萌成复赚制子我，能把利用愈细菌口染色除体D痛NA前复制阀和转策录的治同一烤套酶碰系统井，在售细菌多体内超独立咱地进芹行自哑我复乌制及她转录捎。筝作为烂克隆胳载体溜的质跳粒应厚具备列下列课特点春：北企悼（1到）分怀子量毫相对失较小膀，能咏在细冻菌内规稳定堡存在滴，有作较高匀的拷贿贝数闯。拔曲喝（2丘）具匪有一脚个以绢上的艰遗传蜻标志妻，便烂于对喝宿主凯细胞剖进行宰选择均，如勉抗生竞素的筛抗性咸基因母，盈β故-半哄乳糖佩苷酶苦基因项（L栽ac扒Z弱）等岸。歼驱剧（3汽）具绳有多铜个限腥制性脊内切悼酶的尸单一祝切点物，便肺于外距源基拿因的急插入耻。如沃果在祝这些傲位点防有外作源基峡因的厨插入娘，会系导致淹某种邮标志厘基因踪的失恨活，遗而便证于筛胀选。禁质粒添一般场只能失容纳满小于宝10敢kb孩的外半源D尸NA舟片段猛。衣二、献λ杆噬菌容体念欺骂噬菌浊体(尤ba泄ct四er年io赌ph时ag词e,短p坛ha屠ge支)是关感染浇细菌烧的病背毒，井用冲作克孕隆载服体的饶噬菌牙体有昌两种然：一形种是美λ帐噬菌稳体，亏另一牺种是疮M1泛3噬狮菌体这。诞寺供野生甚型推λ匙噬菌喂体经鸡过改剃造，哪已衍句生出烘10扰0多绵种克资隆载掏体。爱商λ都噬菌碗体载孔体分疑为插奔入型挨和替骑换型坚(置猪换型翁)两雁类。鸦壮很目前船应用察较广肉的是馋EM捷BL贼系列喜、泊λ率gt饱系列股和C猛ha租ro切n系保列等坡。联λ陷gt塞10删和刘λ辨gt蓄11乔载体睁适用喉于建看立c遣DN黑A文云库。困这两词个载塑体都扫属插宫入型刮载体凑，能独克隆块7k巡b以纺下的勇外源五DN装A。咽塌λ牢gt贫11稠为表牌达型旁载体挤。素三、障粘性跪质粒拖（c兼os称mi狮d）掩狐丰粘性赔质粒廉是由谎λ坊噬菌康体的屋噬菌改体的升粘性征末端从（c摩os拉区）帆与质缸粒重韵新构小建的么载体俱，为阴双链众、环库状D径NA妄。其埋克隆询容量青可达柏40育～5查0k瑞b。铲代四、该M1醉3噬纷菌体挨龙盏M1介3噬荷菌体男（M验13配p绩ha吓ge铸）是核一种队大肠驱杆菌哀雄性葡特异体丝状挽噬菌泛体，堡全长阴约6莫.5缝kb外。M视13盼感染被细菌晓后，晋经过脚复制道转变寇为双铁链的修复制乒型（昨RF廊）。攀复制践型M践13沟可用鹿作克胁隆载奔体。件当每集个细坡菌体汽内的那复制扫型M弟13猜拷贝圣数积乘累到纳10昂0～商20形0后勾，M樱13累的合等成就桥变得耻不对朗称，贯只有懂其中膝一条唤链进虫行复恳制，映产生工大量温的单洁链D侄NA腿，并话被包裳装到鞭成熟摩的噬培菌体播颗粒夫中，封然后登从细嘱菌中影排出鹿。M抖13狮噬菌省体的浓最大智优点帮在于覆从细亏菌体咽内释畜放出电的颗毯粒中良所含颠的单贞链D团NA斜。颂五、栗病毒把载体孟语破逆舱转录恰病毒盖、腺使病毒泊、腺糟相关吐病毒让、E虎B病踢毒等赢作为项基因迎转移刚的载病体。规多数樱病毒神载体宅均已角质粒悠化，酸病毒示载体洗质粒捷主要甜由病漏毒启尸动子赞、包页装元型件、蓬选择米性遗阁传标霞记，喜以及倒pB败R3遗22书的复锄制子蚊组成咸。耗第三忆节突拼蛾基因纺克隆纲的基队本过控程混串湾厌基因改克隆性主要财分为鄙以下洗几个矮步骤宫：妙①蕉制备输目的雹基因植和相骂关载督体；腾②墓将目琴的基象因和芒有关启载体美进行掌连接纲；剩③备将重瘦组的煎DN童A导删入受拦体细口胞；裂④沾DN型A重墨组体舌的筛矛选和造鉴定扭；佣⑤村DN此A重魄组体赵的扩挎增、状表达驰和其姨他研遗究。卖变一、讯链目敢的基邮因的升获得嫂（一详）从骆基因锄组文评库中音获得关痒折一蝇个生够物体障的基粘因组源ＤＮ跪Ａ用颠限制清性内弊切酶福部分锤酶切燥后甩,将闯酶切暑片段附克隆矛在载倾体Ｄ槽ＮＡ嗽分子芬中晓,所劣有这毒些插绪入了千基因链组Ｄ轻ＮＡ绞片段贤的载弱体分朗子的控集合奇体矮,将素包含秘了这海个生违物体貌的整棵个基律因组幼,国也就肯是构回成了渣这个何生物拳体的薄基因丘文库歉。础（二邀）从献cD冻NA度文库拒（c摘DN昏A猾li荡br刘ar泡y）鹿中获伴得久预怜c洁DN丰A文必库是膜指某重种特御定细驶胞及趁特定棋状态梯下的员全部盛cD煮NA纲克隆浑.猎（笑三）粮PC舍R扩具增越特定宇基因菊（四潜）晃人工肝合成买二.鸡载体漠的选尼择牵与准炒备第根据养目的掀基因逗的大阿小和段研究单的目午的选糊择合壳适的踏载体桌。陵三、返DN窝A分跌子的爸体外刮连接怜（一伟）黏医性末抚端筑（二印）人凝工接慰头的乔使用匹（三乳）加果入同尤聚体灭尾相（四瘦）平堡端连蜓接忍四占、鹊外源凯基因则导入仍宿主荣细胞鸦充芹将重概组D陕NA斑或其块他外让源D且NA往导入粥宿主音细胞扭，常朋用的事方法挪有转孩化（榴tr科an尿sf李or岛ma建ti栗on察）感繁染（帐in喝fe闯ct分io术n）职和转毒染（奸tr络an痰sf核ec杠ti院on驰）.敲毒（一期）转扶化（为tr她an浸sf惊or喜ma猪ti事on趟）迁磨吗涂转抵化是满指将蚀质粒乘或其犹他外腿源D搁NA贯导入戴处于化感受菌态的惕宿主搜细胞罢，并销使其穗获得碌新的挎表型煌的过巷程。柔转化况常用蹲的宿瓣主细收胞是性大肠百杆菌选。大铲肠杆旦菌悬娘浮在喉Ca牛Cl侮2溶巨液中次，并灾置于翁低温仗（0米～殖5六℃原）环少境下言一段察时间术，钙纷离子众使细污胞膜授的结救构发棒生变江化，年通透尚性增归加，锅从而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