食品中微生物快速检验技术

第六章食品中微生物快速检验技术学习目标当前第1页\共有45页\编于星期四\23点第六章食品中微生物快速检验技术概述1、食品中微生物检测的优点和发展趋势检测食源细菌的传统方法通常依赖于其在培养基里的生长,即进行目标菌的分离和生化鉴定,有时进行血清学诊断繁琐、耗时。随着分子生物学和电子技术的飞速发展,快速、准确、特异检微生物的新技术、新方法不断涌现,微生物检验技术由培养水平向分子水平迈进,并向仪器化、动化、标准化方向发展,可大大提高食品微生物检验工作的高效性、准确性和可靠性。当前第2页\共有45页\编于星期四\23点第六章食品中微生物快速检验技术概述2、食品中微生物检测的局限性大部分快速方法适用于检测特定微生物，用于快速筛选大量食品中所存在的特殊病原体。然而，快速检方法抗干扰能力弱，所得结果必须用标准参考方法予以证实。因此,随着某些快速方法更加频繁地被使用,其优点和局限性同时变得更加明显，使用在选择和彻底评估这些快速检测方法时，必须综合考虑各方面因素，在工作效率和可靠性上找到一个平衡点。当前第3页\共有45页\编于星期四\23点第五章食品中微生物标准检验与分析技术第一节3M测试片快速分析技术当前第4页\共有45页\编于星期四\23点一、什么是3M测试片？

第六章食品中微生物快速检验技术第一节3M测试片快速分析技术当前第5页\共有45页\编于星期四\23点二、3M测试片的优点

第六章食品中微生物快速检验技术第一节3M测试片快速分析技术1.工作效率的极大提高根据大量数据统计，使用3MPetrifilm，可以提高实验室工作效率118%以上。劳动资源的最佳使用带来生产能力的提高，最终的效果就是效益的增加。2.标准化的检测方法品质稳定的快速测试片克服了传统的测试方法存在的由于使用不同批次的培养基，不同的配制条件，不同配制人员而导致的差异性。3.国际化的认证方法3M快速测试的方法得到包括AOAC，AFNOR在内的国际权威机构的认证，在全球许多国家也已获得官方机构的正式批准，从而可以确保检测结果的可靠性和在世界各地的广泛认可。当前第6页\共有45页\编于星期四\23点二、3M测试片的优点

第六章食品中微生物快速检验技术第一节3M测试片快速分析技术4.快速得到检测结果对比传统的测试方法，3M快速测试片缩短检测时间，使您在更短的时间内获得样品的测试结果，能更加迅速地采取有效的措施解决发现的问题。5.方便进行HACCP认证由于检测速度快，检测项目全，准确性高。3M为食品生产工艺过程中关键控制点的监控提供了较为完整的系列产品，可以对包括生产线，生产设备和环境在内的各个环节进行全面的测试。

当前第7页\共有45页\编于星期四\23点三、3M测试片的操作过程（肠杆菌科为例）

第六章食品中微生物快速检验技术第一节3M测试片快速分析技术当前第8页\共有45页\编于星期四\23点三、3M测试片的操作过程（肠杆菌科为例）

第六章食品中微生物快速检验技术第一节3M测试片快速分析技术当前第9页\共有45页\编于星期四\23点四、3M测试片的结果判读图例

第六章食品中微生物快速检验技术第一节3M测试片快速分析技术当前第10页\共有45页\编于星期四\23点四、3M测试片的结果判读图例

第六章食品中微生物快速检验技术第一节3M测试片快速分析技术当前第11页\共有45页\编于星期四\23点四、3M测试片的结果判读图例

第六章食品中微生物快速检验技术第一节3M测试片快速分析技术当前第12页\共有45页\编于星期四\23点四、3M测试片的结果判读图例

第六章食品中微生物快速检验技术第一节3M测试片快速分析技术当前第13页\共有45页\编于星期四\23点四、3M测试片的结果判读图例

第六章食品中微生物快速检验技术第一节3M测试片快速分析技术当前第14页\共有45页\编于星期四\23点四、3M测试片的结果判读图例

第六章食品中微生物快速检验技术第一节3M测试片快速分析技术当前第15页\共有45页\编于星期四\23点四、3M测试片的结果判读图例

第六章食品中微生物快速检验技术第一节3M测试片快速分析技术当前第16页\共有45页\编于星期四\23点四、3M测试片的结果判读图例

第六章食品中微生物快速检验技术第一节3M测试片快速分析技术当前第17页\共有45页\编于星期四\23点四、3M测试片的结果判读图例

第六章食品中微生物快速检验技术第一节3M测试片快速分析技术当前第18页\共有45页\编于星期四\23点第五章食品中微生物标准检验与分析技术第二节Mini-VIDAS快速分析测试技术当前第19页\共有45页\编于星期四\23点一、Mini-VIDAS快速分析技术简介

第六章食品中微生物快速检验技术第二节Mini-VIDAS快速分析测试技术当前第20页\共有45页\编于星期四\23点二、Mini-VIDAS快速分析技术原理

第六章食品中微生物快速检验技术第二节Mini-VIDAS快速分析测试技术1、在固相包被抗体，捕获目标菌。2、二抗酶结合物结合目标菌，催化底物产生荧光。1、在固相包被抗体，捕获目标菌酶结合物。2、目标菌抑制抗体和酶结合物结合，抑制催化底物产生荧光。当前第21页\共有45页\编于星期四\23点三、Mini-VIDAS快速分析技术优势

第六章食品中微生物快速检验技术第二节Mini-VIDAS快速分析测试技术当前第22页\共有45页\编于星期四\23点三、Mini-VIDAS快速分析技术优势

第六章食品中微生物快速检验技术第二节Mini-VIDAS快速分析测试技术当前第23页\共有45页\编于星期四\23点第五章食品中微生物标准检验与分析技术第三节利用电导率快速分析测试技术当前第24页\共有45页\编于星期四\23点一、电导率快速检测微生物技术原理

第六章食品中微生物快速检验技术第三节利用电导率快速分析测试技术

微生物在生长过程中利用低电导率的大分子物质(如蛋白质，多肽及碳水化合物等)进行新陈代谢，生成低分子带电荷的分解物，使电导率发生变化。电信号经放大后显示并记录，检测系统每10分钟检测一次电导率的变化，由计算机实时监控并自动给出结果。因此只要先用标准方法对比做出标准曲线，就可以达到快速定量检测菌数的目的。

当前第25页\共有45页\编于星期四\23点一、电导率快速检测微生物技术原理

第六章食品中微生物快速检验技术第三节利用电导率快速分析测试技术样品中微生物数量越多，越快进入对数生长期。培养基电导率发生跃迁的时间越短。当前第26页\共有45页\编于星期四\23点二、电导率快速检测微生物技术特点

第六章食品中微生物快速检验技术第三节利用电导率快速分析测试技术1.采用测量培养基电导(M值)和电极电导(E值)结合的方法，测量相对电导率变化，使灵敏度大大提高，E值测量法尤其适用于一些高盐分(高电导率)的选择性增菌培养基，使电导率法用于致病菌快速初筛成为可能。2.对难以测量电导变化的微生物，采用测间接电导率的方法，通过测量KOH吸收微生物代谢产生CO2后电导率的变化反映微生物的生长情况。当前第27页\共有45页\编于星期四\23点三、电导率快速检测微生物技术优势

第六章食品中微生物快速检验技术第三节利用电导率快速分析测试技术1.灵敏度高。最低可检测出0.2-1个/mL(克)样品。2.可检测样品种类广，检测的微生物项目多。3.检测速度快。大部分项目24小时内出结果，样品含菌量越高，出结果越快，只需数小时即给出结果。4.检测步骤简单。厂家提供特殊配方的培养基，只需将样品加入培养基中，放入仪器，然后启动程序即可自动出结果。对于液体样品无需复杂前处理，固体样品只需进行必要的均质和稀释即可。当前第28页\共有45页\编于星期四\23点一、膜过滤荧光染色法原理

第六章食品中微生物快速检验技术第四节膜过滤荧光染色法2.标记3.激光扫描1.过滤当前第29页\共有45页\编于星期四\23点二、膜过滤荧光染色法步骤

第六章食品中微生物快速检验技术第四节膜过滤荧光染色法当前第30页\共有45页\编于星期四\23点三、膜过滤荧光染色法仪器

第六章食品中微生物快速检验技术第四节膜过滤荧光染色法当前第31页\共有45页\编于星期四\23点一、利用葡萄糖醛酸酶定量检测E.Coli

大肠杆菌重要卫生学指标，是环境监测、食品安全、卫生防疫监测中必检的一个项目。传统的大肠菌群检测法试验过程繁杂、检测工作量大、费用较高，而且不适合进行大肠杆菌定量检测。绝大多数大肠杆菌具有葡萄糖醛酸酶，能分解葡萄醛酸苷。使无色原性-底物（4甲基伞花内脂β-D葡萄糖苷酸）生成甲基伞形酮葡萄糖苷酸，在365nm紫外灯下观察出现蓝亮色荧光，可以实现定量检测。

第六章食品中微生物快速检验技术第五节利用酶促反应定量检测微生物当前第32页\共有45页\编于星期四\23点二、ATP荧光法检测总菌落数

第六章食品中微生物快速检验技术第五节利用酶促反应定量检测微生物

萤火虫会发光是由于它能合成将化学物质的化学能转变为光能的生物催化剂—荧光素酶、虫荧光素(D-luciferin)以及所有细胞生物都产生的生物能量物质—三磷酸腺苷（ATP）。在有氧的条件下，虫光素酶催化虫荧光素和ATP之间发生氧化反应，形成氧化荧光素并发出荧光，其生化反应式如下：当前第33页\共有45页\编于星期四\23点二、ATP荧光法检测总菌落数

第六章食品中微生物快速检验技术第五节利用酶促反应定量检测微生物

上式表明，只要具备适当条件，不仅萤火虫，即使在试管中也能发出荧光。当反应系统中，虫光素酶和虫荧光素处于过量的情况下，荧光的强弱取决于ATP的数量。

在食品样品中，细菌细胞越多，ATP量越高，发出的荧光也就越强。所以，在排除样品中非细菌ATP干扰的情况下，通过荧光值就能确定样品中细菌ATP的含量，从而确定细胞数量。当前第34页\共有45页\编于星期四\23点检测原理荧光素荧光素酶腺苷一磷酸氧合荧光素荧光当前第35页\共有45页\编于星期四\23点三、MTT法检测总菌落数

第六章食品中微生物快速检验技术第五节利用酶促反应定量检测微生物检测原理为活体微生物线粒体中含有琥珀酸脱氢酶，能使外源性MTT（噻唑蓝）还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。Formazan结晶形成的量与活菌数成正比。用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活菌细胞数量。该方法的特点是检测灵敏度高、快速。在肿瘤细胞杀伤药物筛选中应用广泛，在食品卫生监测中也有应用的报道。当前第36页\共有45页\编于星期四\23点三、MTT法检测总菌落数

第六章食品中微生物快速检验技术第五节利用酶促反应定量检测微生物应用实例1：巴氏消毒奶中活菌素快速检测

取巴斯消毒奶10mL，至于无菌离心管中3000rpm离心5分钟，弃去上清。加入10mL无菌生理盐水洗涤离心管，再次3000rpm离心5分钟，弃去上清取出奶液基质。加入1mL生理盐水重悬底部的微生物，取0.2mL到96孔酶标板中，同时加入标准菌液做标准曲线，统一加入底物反应30分钟，读数。当前第37页\共有45页\编于星期四\23点一、血清学方法

第六章食品中微生物快速检验技术第六节利用免疫反应快速检测微生物图示几种操作类型的原理当前第38页\共有45页\编于星期四\23点一、血清学方法(基本原理回顾第3章)

第六章食品中微生物快速检验技术第六节利用免疫反应快速检测微生物实例1：化脓性链球菌的免疫聚集快速检测菌体凝集试验免疫散射比浊法当前第39页\共有45页\编于星期四\23点二、酶联免疫吸附检测方法

第六章食品中微生物快速检验技术第六节利用免疫反应快速检测微生物ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术。

分点理解:

1.

抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记；2.结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性；3.酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留其酶的活性。

在ELISA测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）当前第40页\共有45页\编于星期四\23点固相载体抗体抗原酶抗体