课题 微生物的实验室培养

课题微生物的实验室培养第一页，共四十页，编辑于2023年，星期一一、基础知识（一）培养基1、概念人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。2、培养基的类型和用途（1）按物理性质划分：①液体培养基③半固体培养基②固体培养基注：（固体、半固体培养基需添加凝固剂，如琼脂；两者的差别是添加量的多、少；液体培养基不加凝固剂。）（用于工业生产）（微生物保存、分离、鉴定、活菌计数）（观察微生物的运动、分类、鉴定）第二页，共四十页，编辑于2023年，星期一液体培养基与固体培养基第三页，共四十页，编辑于2023年，星期一（2）按化学成分划分：①合成培养基培养基成分明确（用化学成分已知的化合物配制）（微生物的分类、鉴定）②天然培养基含化学成分不明的天然物质（工业生产）（3）按用途划分：①选择培养基加入某化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要微生物的生长。（作用：分离微生物、进行选择培养，进行选择培养可以增加所需目的菌的浓度。）第四页，共四十页，编辑于2023年，星期一青霉素抗青霉素基因基因工程，对导入重组质粒的大肠杆菌的筛选第五页，共四十页，编辑于2023年，星期一不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物加入青霉素的培养基:分离到酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:

分离固氮菌②鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同种类的微生物。第六页，共四十页，编辑于2023年，星期一伊红－美蓝AABBCCDD大肠杆菌在伊红－美蓝培养基上菌落呈现黑色

注：病毒专性活细胞寄生，目前不能利用人工培养基来培养，需接种在动植物组织中才能增值。常用于培养动物病毒的是活鸡胚。第七页，共四十页，编辑于2023年，星期一3、培养基的成分不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。（1）碳源为微生物提供所需碳元素的营养物质，需要量最大。①概念：②来源：无机碳源：CO2、NaHCO3等有机碳源：糖类（常用的碳源尤其是葡萄糖）

、脂肪酸、花生粉饼、石油等③作用：构成细胞的物质和一些代谢产物；有些是异养微生物的能源；思考：大肠杆菌，硝化细菌，蓝藻，乳酸菌分别选用哪种碳源？糖类，二氧化碳，二氧化碳，糖类第八页，共四十页，编辑于2023年，星期一（2）氮源①概念：为微生物提供所需氮元素的营养物质。②来源：无机氮源：N2、NH3、NH4+、NO3-等。有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等③作用：主要用于合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物。注：“含C、N”的有机物常是异养微生物的氮源，也是碳源，即有些化合物作为营养要素成分时并不是单一方面的作用。思考：培养根瘤菌、大肠杆菌、硝化细菌时分别需要哪一类氮源？N2，铵盐或硝酸盐，NH3第九页，共四十页，编辑于2023年，星期一（3）水（4）无机盐（5）培养基内所需的其他条件①概念：微生物生长不可缺少的微量有机物。注：并不是所有微生物都需要添加特殊营养物质，有些需要添加，原因是它们自身缺乏合成这些物质的酶或合成能力有限。如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生素。②来源：维生素、氨基酸、碱基等。③作用：酶、核酸的组成成分。Ⅰ、特殊营养物质（生长因子）第十页，共四十页，编辑于2023年，星期一Ⅱ、pH值如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性。Ⅲ、氧气的含量如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件。4、培养基的配制原则（1）目的要明确（根据微生物的种类、培养目的）（2）营养协调（注意营养物质的浓度和比例）（3）pH适宜第十一页，共四十页，编辑于2023年，星期一例1：为了检测饮用水中是否含有某种细菌，配制的培养基的配方如下表：

(1)该培养基所含的碳源有________________，其功能是________________。

(2)该培养基所含的氮源是________________，其功能是________________。

(3)该培养基除含碳源、氮源外，还有微生物需要的营养物质是________________。

(4)该细菌在同化作用上的代谢类型是________________。

(5)该培养基可用来鉴别哪种细菌(

)

A．霉菌 B．大肠杆菌C．酵母菌D．乳酸菌乳糖、蔗糖、蛋白胨构成微生物的细胞物质和一些代谢产物蛋白胨合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物水、无机盐异养型C第十二页，共四十页，编辑于2023年，星期一（二）无菌技术1、概念

泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。获得纯净培养物的关键（目的）:防止外来杂菌的入侵。2、无菌技术包括的四个方面（措施）（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。第十三页，共四十页，编辑于2023年，星期一3、消毒与灭菌（1）消毒①概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。在生物体的一定部位产生一种特殊的生殖细胞叫孢子。孢子的特点是能直接长成新个体。第十四页，共四十页，编辑于2023年，星期一②常用方法:a、煮沸消毒法100℃煮沸5-6min，用于一般物品的消毒。b、巴氏消毒法70-75℃下煮30min或80℃下煮15min，对一些不耐高温的液体，如牛奶的消毒。c、化学药剂消毒酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等，如酒精擦拭双手、氯气消毒水源等。d、紫外线消毒对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后使用紫外线进行物理消毒。只适用于表面灭菌和空气灭菌。第十五页，共四十页，编辑于2023年，星期一（2）灭菌使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。常用方法:a、灼烧灭菌用于金属用具（接种环、接种针）、接种过程中试管口和瓶口的灭菌；b、干热灭菌160～170℃，1～2h。能耐高温的需要保持干燥的物品，用于玻璃器皿、金属用具的灭菌，所用设备是干热灭菌箱

；c、高压蒸汽灭菌121℃，100kPa，15-30分钟。用于培养基、无菌水等的灭菌，所用设备是高压蒸汽灭菌锅。第十六页，共四十页，编辑于2023年，星期一二、实验操作(以培养大肠杆菌为例)（一）制备牛肉膏蛋白胨培养基1、计算2、称量注意：①牛肉膏比较黏稠，天平称量时，放等大的称量纸，防止牛肉膏粘在托盘上；②牛肉膏和蛋白胨都易吸潮，称取时动作迅速，称后要及时盖上瓶盖。第十七页，共四十页，编辑于2023年，星期一3、溶化牛肉膏和称量纸+水取出称量纸加热加蛋白胨和氯化钠搅拌加琼脂（不断搅拌，防止糊底而导致烧杯破裂）补加蒸馏水至100ml思考溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热?可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中,减少误差。加琼脂的目的是什么?作为凝固剂第十八页，共四十页，编辑于2023年，星期一4、灭菌①培养基：高压蒸汽灭菌②培养皿：干热灭菌思考在灭菌前,用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的是什么？灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞；取出培养基锥形瓶时也能起到隔绝空气中杂菌污染的作用。培养皿能否用高压蒸汽灭菌？不能,因为培养皿要保持干燥,应该用干热灭菌。在培养微生物时，由于不同微生物适应的PH不同，因此在熔化后必须条件PH，那么是先调PH还是先灭菌?先调PH，后灭菌。第十九页，共四十页，编辑于2023年，星期一5、倒平板第二十页，共四十页，编辑于2023年，星期一用手触摸锥形瓶，温度下降到刚刚不烫手时即可开始倒平板。灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。思考培养基灭菌后要冷却到50℃时倒平板。用什么办法来估计培养基的温度？为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？第二十一页，共四十页，编辑于2023年，星期一平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染,又可以避免培养基中的水分过快地挥发。空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。平板冷凝后，为什么要将平板倒置？在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？第二十二页，共四十页，编辑于2023年，星期一（二）纯化大肠杆菌1、纯化培养技术：自然环境中，微生物混在一起生长，要想纯培养，首先要将单个细胞与其他细胞分离开，进而培养成可见的群体（即菌落）。2、细菌的菌落①定义：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体。②特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。③功能：菌种鉴定的重要依据。第二十三页，共四十页，编辑于2023年，星期一形态各异的菌落第二十四页，共四十页，编辑于2023年，星期一3、常用接种方法平板划线法稀释涂布平板法（主要用于纯化培养）（主要用于分离菌种并计数）(1)平板划线法：通过接种环在固体培养基表面连续划线操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可分离到由一个细胞繁殖而来的菌落。接种环第二十五页，共四十页，编辑于2023年，星期一第二十六页，共四十页，编辑于2023年，星期一平板划线法获取的微生物经恒温培养后的生长情况第二十七页，共四十页，编辑于2023年，星期一为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？操作结束后灼烧：杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境及感染操作者。思考第一步灼烧：消灭接种环上的微生物避免污染培养物；每次划线前灼烧：为了杀死上一次划线结束后，接种环残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。第二十八页，共四十页，编辑于2023年，星期一在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。第二十九页，共四十页，编辑于2023年，星期一(2)稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释后，分别涂布到固体培养基表面。稀释度足够高时，能培养出单个菌落。稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板操作。涂布器第三十页，共四十页，编辑于2023年，星期一系列稀释操作101102103104105106第三十一页，共四十页，编辑于2023年，星期一涂布平板操作第三十二页，共四十页，编辑于2023年，星期一对涂布器进行灼烧灭菌；吸管头不要接触任何物体；在火焰周围迅速操作。接种过程中如何进行无菌操作？思考

将接种后和未接种（作为对照组）的培养基均放到370C的恒温箱中，培养12～24h后进行观察并记录结果。第三十三页，共四十页，编辑于2023年，星期一未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、形状、颜色相似的菌落。三、结果分析与评价1、未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？2、在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似吗？第三十四页，共四十页，编辑于2023年，星期一培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。无菌操作未达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可能是接种时发生了污染；也可能是在培养的过程中受到了污染。3、培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因？4、如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析其可能的原因。第三十五页，共四十页，编辑于2023年，星期一将菌种接种到试管的固体斜面培养基，放入4℃冰箱中保存。以后每3~6个月，要将菌种转移到新的培养基。四、课题延伸1、菌种的临时保存：2．菌种的长期保存：3ml甘油瓶中装入1ml甘油后灭菌，再加入1ml菌液，混匀后放入-20℃冷冻箱保存。第三十六页，共四十页，编辑于2023年，星期一例2：高中生物学实验中，在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是 （）A．将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中 B．将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上C．将转基因植物叶片接种到无菌培养基上 D．将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上C第三十七页，共四十页，编辑于2023年，星期一例3：下列有关细菌培养的叙述，正确的是（）A．在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌B．在培养基中加入青霉素可抑制真