蛋白质结构解析技术二

一、概述1、核磁共振2、简单历史回顾3、核磁共振仪器的进展当前第1页\共有125页\编于星期六\11点一、概述1、核磁共振（Nuclearmagneticresonance,NMR）在静磁场中，自旋的原子核发生能级（塞曼）分裂，特征能量的电磁波引起原子核磁能级共振跃迁并吸收特征能量电磁波的现象。称为“核磁共振”或“核移跃迁”。电磁波与磁场中的原子核作相互用，产生核磁共振。NMR属于吸收光谱，与UV-vis和红外光谱法类似。核磁共振波谱学是光谱学的一个分支，处于电磁波的最低端——无线电波段。当前第2页\共有125页\编于星期六\11点是物质结构定性分析最强有力的工具之一，亦可进行定量分析。如：测定有机化合物的结构

1HNMR──分子中氢原子的位置、环境以及官能团和C骨架上的H原子相对数。

CHCH2CH3中H的比值或相对数量当前第3页\共有125页\编于星期六\11点2、简单历史回顾1946年F.Bloch(斯坦福大学)&EMPurcell（哈弗大学）领导的两个小组几乎同时观察到核磁共振现象。Bloch水中质子的信号，Purcell石蜡中质子共振信号，1952年获Nobel物理奖1950发现化学位移，随后偶合常数，弛豫时间，引起化学界高度重视1953年第一台核磁共振仪器问世，1H研究较成熟1970年脉冲傅里叶变换核磁共振仪，灵敏度提高，13C核磁共振蓬勃发展。1971年Jeener二维核磁谱建立了化学位移与偶合常数的关系、同核和异核成键作用的关系、空间作用的关系，分析物质的空间结构。当前第4页\共有125页\编于星期六\11点1987年Emst论述了二维NMR理论和实验原理（91年获诺奖），在此基础上，学术界开展了多核NMR深入研究。NMR在固态分析发展1971年ERAndrew固体NMR研究，1976年MMehring固体NMR专著，1993年专著—固体NMR高分辨率原理NMR成像技术的发展1973年美Paul.C.Lauterbur核磁共振成像技术。物理学随着无线电电子学、数学图像处理、计算机技术、应用数学等领域随后，在医学领域NMR成像系统及广泛应用当前第5页\共有125页\编于星期六\11点*3、核磁共振仪器的进展核磁共振在仪器、实验方法、理论和应用等方面飞跃进步。谱仪频率已从30MHz发展到1000MHz。仪器工作方式从连续波谱仪发展到脉冲-傅里叶变换谱仪。谱图已从一维谱到二维谱、三维谱甚至更高维谱。应用学科从化学、物理扩展到生物、医学等多个学科。核磁共振成像技术还可以与断层扫描技术(CT)结合为临床诊断和生理学、医学研究提供重要数据总之，核磁共振已成为最重要的仪器分析手段之一。当前第6页\共有125页\编于星期六\11点*在医学诊断中NMR的优势是诊断早期病变的临床医学影像技术，对患者和检查者安全。相对于X-射线透视技术和放射造影技术，NMR对人体辐射小。相对于超声探测技术，NMR成像更加清晰，显示更多细节。相对于其他成像技术，核磁共振成像不仅仅能够显示有形的实体病变，而且还能够对脑、心、肝等功能性反应进行精确的判定在帕金森氏症、阿尔茨海默氏症、癌症等疾病的诊断方面，NMR技术都发挥了非常重要的作用。当前第7页\共有125页\编于星期六\11点经典核磁共振波谱仪当前第8页\共有125页\编于星期六\11点傅立叶变换核磁共振波谱仪不是通过扫场或扫频产生共振；恒定磁场，施加全频脉冲，产生共振，采集产生的感应电流信号，经过傅立叶变换获得一般核磁共振谱图。（类似于一台多道仪）当前第9页\共有125页\编于星期六\11点超导核磁共振波谱仪：永久磁铁和电磁铁：

磁场强度<25kG超导磁体：铌钛或铌锡合金等超导材料制备的超导线圈；在低温4K，处于超导状态；磁场强度>100kG开始时，大电流一次性励磁后，闭合线圈，产生稳定的磁场，长年保持不变；温度升高，“失超”；重新励磁。超导核磁共振波谱仪：

200-400HMz；可高达600-700HMz；当前第10页\共有125页\编于星期六\11点核磁共振应用

核磁共振适合于液体、固体。如今的高分辨技术，还将核磁用于了半固体及微量样品的研究。核磁谱图已经从过去的一维谱图（1D）发展到如今的二维（2D）、三维（3D）甚至四维（4D）谱图，陈旧的实验方法被放弃，新的实验方法迅速发展，它们将分子结构和分子间的关系表现得更加清晰。在世界的许多大学、研究机构和企业集团，都可以听到核磁共振这个名词，包括我们在日常生活中熟悉的大集团。而且它在化工、石油、橡胶、建材、食品、冶金、地质、国防、环保、纺织及其它工业部门用途日益广泛。在中国，其应用主要在基础研究方面，企业和商业应用普及率不高，主要原因是产品开发不够、使用成本较高。但在石油化工、医疗诊断方法应用较多。作为蛋白质的结构测定和解析中有力工具当前第11页\共有125页\编于星期六\11点一些实际的应用分子结构的测定化学位移各向异性的研究金属离子同位素的应用动力学核磁研究质子密度成像T1T2成像化学位移成像其它核的成像指定部位的高分辨成像元素的定量分析有机化合物的结构解析表面化学有机化合物中异构体的区分和确定大分子化学结构的分析生物膜和脂质的多形性研究脂质双分子层的脂质分子动态结构生物膜蛋白质——脂质的互相作用压力作用下血红蛋白质结构的变化生物体中水的研究生命组织研究中的应用生物化学中的应用在表面活性剂方面的研究原油的定性鉴定和结构分析沥青化学结构分析涂料分析农药鉴定食品分析药品鉴定当前第12页\共有125页\编于星期六\11点二、核磁共振基本原理核磁共振的基本原理原子核的自旋和磁矩核的进动和磁能级核磁共振的条件弛豫过程核磁共振仪器的工作原理工作原理实现核磁共振的两种方法样品制备方法要求掌握当前第13页\共有125页\编于星期六\11点1、原子核的自旋和磁矩（1）核自旋I：自旋量子数；h：Planck常数；P：自旋角动量质量数原子序数自旋量子数实例偶数偶数012C,16O,32S,28Si,30Si,32S等奇数奇数或偶数1/21H,13C,15N,19F,29Si,31P等奇数奇数或偶数3/2，5/2…..11B,17O,33S,35Cl,37Cl,127I等偶数奇数1,2,3……2H,10B,14N等原子核的自旋量子数核自旋具有角动量（矢量）核自旋角动量和自旋量子数的关系式：（一）核磁共振的基本原理当前第14页\共有125页\编于星期六\11点（2）磁矩原子核是带电粒子，自旋运动时产生磁场，形成磁偶极子，具有磁的性质。核磁矩(μ)：两个磁极间的磁偶极的大小，矢量，方向与和自旋角动量（P）重合。其大小关系：μ=

P 其中为核磁旋比（磁矩和P的比值）自旋角动量(P)是量子化的，根据量子学原则，在外加磁场（H0）方向(沿z轴)的分量（Pz），是h/(2π)的倍数，倍数可用自旋量子数（I）表示当前第15页\共有125页\编于星期六\11点2、核的进动和磁能级（1）核的进动自旋核在外加磁场中，核自旋行为像重力场中旋转的陀螺，核一方面自旋，一方面围绕磁场旋转，这种运动方式称进动，也称拉莫尔（Larmor）进动。核自旋轴（同核磁矩矢量重合）和H0轴（回旋轴）成一角度（θ），自旋核就绕H0轴进动。进动频率（ν0）称Larmor频率，Larmor频率随磁场强度增大而增大（ν0∝H0）陀螺的旋进运动模拟外磁场中的磁性核当前第16页\共有125页\编于星期六\11点（2）核能分裂（磁能级）根磁学原理，核磁矩在外磁场（H0）中的具有能量（E）磁量子数（m)：自旋核在H0中有不同取向，m共有（2I+1）个取向，每个自旋取向代表原子核处于某种特定能量状态，称为~。若I=1/2，则有2种取向，磁能级不同m=+1/2，E（+1/2）=-μzH0（能量低）；

m=-1/2，E（-1/2）=+μzH0（能量高）（负号：表示“核磁矩（μ）与H0的方向”，顺向能量低，反向能量高）2种取向（磁能级）的能量差ΔE=E（-1/2）-E（+1/2）当前第17页\共有125页\编于星期六\11点小结

核磁共振现象

自旋量子数I=1/2的原子核（如：1H），可当作电荷均匀分布的球体，绕自旋轴转动时，产生磁场，类似一个小磁铁。当置于外磁场H0中时，相对于外磁场，m有（2I+1）种取向：氢核（I=1/2），两种取向（两个能级）：与外磁场平行，能量低， 磁量子数ｍ＝＋1/2;(2)与外磁场相反，能量高， 磁量子数ｍ＝－1/2;发生核磁共振，就要吸收特征能量。当前第18页\共有125页\编于星期六\11点3、核磁共振条件在外磁场（H0）中，原子核能级裂分。射频振荡线圈产生电磁波，产生与H0垂直的震荡磁场H1。改变射频，其频率与自旋核的Larmor进动频率（ν0

）相等时核吸收射频波的能量，由低能级向高能级跃迁，即核磁共振共振条件：射频磁场的频率（ν

）ν

=ν0=H0/(2)如：H0=14092Gsν

=H0/(2)=60MHz当前第19页\共有125页\编于星期六\11点ν

=ν0=H0/(2)推论若磁场固定，频率（ν）值取决于磁旋比（）值不同的核，在同一磁场中发生核跃迁的频率不同如：1H和19F，H>F，1H需要比19F更大的射频才能发生共振某一射频只能观察一种核的核磁共振（NMR）若固定射频（ν），19F比1H需要更大的H0才能发生共振当前第20页\共有125页\编于星期六\11点4、弛豫过程？： 通过非辐射方式使高能态核回到低能态的过程，保持低能态核数始终大于高能态核数，这个过程称~。弛豫过程的方式（2种）：（1）纵向弛豫（T1）（自旋-晶格）：高能级核将能量传递给周围的分子（固体或液态），最终变为热运动，自旋核回到低能级的过程。 非碰撞传递，传递给回旋频率相等的物质。

T1：液态快，固体慢（2）横向弛豫（T2）（自旋-自旋弛豫）：一个自旋核与另一个自旋核交换能量的过程。各种能级的核数量不变，系统总能量不变。

T2：固体快、液态慢当前第21页\共有125页\编于星期六\11点（二）核磁共振波谱仪工作原理当前第22页\共有125页\编于星期六\11点1、工作原理1．永久磁铁：

提供外磁场，要求稳定性好，均匀，不均匀性小于六千万分之一。外绕扫场线圈。2．射频振荡器：线圈垂直于外磁场，发射一定频率的电磁辐射信号。如：60MHz或100MHz。当前第23页\共有125页\编于星期六\11点3．射频信号接受器（检测器）：当质子的进动频率与辐射频率相匹配时，发生能级跃迁，吸收能量，在感应线圈中产生毫伏级信号。4．样品管：外径5mm玻璃管，测量过程中旋转，磁场作用均匀。当前第24页\共有125页\编于星期六\11点2、实现核磁共振的两种方法（1）扫场法:ν不变，改变H0（常用）（2）扫频法:H0不变，改变νν

=ν0=H0/(2)当前第25页\共有125页\编于星期六\11点3、样品的制备：试样浓度：5~10%；需要纯样品15~30mg；傅立叶变换核磁共振波谱仪——需要纯样品1mg；标样浓度（四甲基硅烷TMS）：1%；溶剂：1H谱——四氯化碳，二硫化碳； 氘代溶剂：氯仿，丙酮、苯、二甲基亚砜的氘代物；当前第26页\共有125页\编于星期六\11点三、核磁共振与化学位移化学位移的产生及表示方法影响化学位移的因素有机化合物化学位移简单介绍当前第27页\共有125页\编于星期六\11点1、化学位移的产生及表示方法（1）化学位移化合物结构中不同位置的原子核，周围的电子云密度不同，核磁共振的频率有差异，即引起共振吸收峰的位移，这种现象称为化学位移。——反映质子核所处的化学环境。物质中所有质子核磁共振频率是否相同呢？共振条件可知：ν

=ν0=•H0/(2)

强度一定的磁场中，H0=14092Gs质子产生的核磁共振频率也一定，即为60MHz则化合物中所有的质子处于一个吸收峰，实际上并非如此，Why？1HNMR:CH3—OH当前第28页\共有125页\编于星期六\11点质子化学位移不同的原因分子中没有完全裸露孤立存在的质子给定照射频率下，原子核外电子云产生感应磁场，与H0磁场方向相反，对H0的磁场具有屏蔽作用。质子产生共振需要更大的外磁场强度（相对于裸露的氢核），来抵消屏蔽影响。感生磁场强度与H0关系感生磁场强度——以屏蔽常数（σ)表示，与H0成正比例关系，电子云密度越大、屏蔽作用越大、σ越大质子核感受到的磁场强度将减小：H0(1-σ)：核共振吸收的频率与H0的关系：0=[

/(2)]H0

(1-)屏蔽常数“σ”反映电子云对质子的屏蔽作用—

不同环境中的质子发生不同的化学位移当前第29页\共有125页\编于星期六\11点（2）化学位移表示方法从吸收频率来看，“化学位移”的单位为“Hz”60MHz仪器，质子共振频率变化约在1000Hz100MHz仪器，质子共振频率的变化约在1700HzH0不同，共振产生的频率不同，无法比较。要求测定几个Hz的精度，测定绝对值非常困难因此，采用相对值的方法表示“化学位移”当前第30页\共有125页\编于星期六\11点（A）1970年IUPAC（国际纯粹与应用化学协会）建议：化学位移用位移常数（δ）来表示，单位：ppm扫频： δ

=（ν样品-ν标准）×106/ν标准

=（ν样品-ν标准）×106/ν仪器扫场： δ

=（H样品-H标准）×106/H标准=（H样品-H标准）×106/H仪器仪器：数十MHz到数百MHZ；测定差值：几十Hz至几百Hz比值：百万分之几，所以×106，单位：ppm（2）化学位移表示方法当前第31页\共有125页\编于星期六\11点（2）化学位移的表示方法（B)位移的标准没有完全裸露的氢核，没有绝对的标准。相对标准： 四甲基硅烷Si(CH3)4，简称：TMS，（内标或外标）

位移常数TMS=0（1970年IUPAC规定）(C)为什么用TMS作为基准?

a.12个氢处于完全相同的化学环境，只产生一个尖峰；

b.屏蔽强烈，位移最大。与有机化合物中的质子峰不重迭；

c.化学惰性；易溶于有机溶剂；沸点低，易回收。当前第32页\共有125页\编于星期六\11点（2）位移的表示方法与裸露的氢核相比，TMS的化学位移最大，但规定TMS=0，其它种类氢核的位移为负值，负号不加（省略）。=[(样-TMS)/TMS]•106(ppm)小，屏蔽作用强，共振需要的磁场强度大，在高场出现，图右侧；

大，屏蔽弱，共振需要的磁场强度小，在低场出现，图左侧；（D）表示规则当前第33页\共有125页\编于星期六\11点2、影响化学位移的因素（4个因素）（1）电负性—去屏蔽效应

与质子相连元素的电负性越强，吸电子作用越强，价电子偏离质子，屏蔽作用减弱，信号峰在低场出现。-CH3

=1.6~2.0，高场；-CH2I=3.0~3.5,位移增大-O-H，-C-H，大小低场高场图1和图2质子的化学位移有何不同？Why？图1甲醇的1HNMR图1碘乙烷的1HNMR当前第34页\共有125页\编于星期六\11点电负性对化学位移的影响（了解）碳杂化轨道电负性：SP>SP2>SP3当前第35页\共有125页\编于星期六\11点（2）磁各向异性效应

价电子产生诱导磁场，质子位于其磁力线上，与外磁场方向一致，对质子具有去屏蔽。当前第36页\共有125页\编于星期六\11点（3）氢键效应形成氢键后1H核屏蔽作用减少，氢键属于去屏蔽效应。原子之间的相互作用力的变化测定物质之间的相互作用当前第37页\共有125页\编于星期六\11点（4）空间效应当前第38页\共有125页\编于星期六\11点空间效应Ha=3.92ppmHb=3.55ppmHc=0.88ppmHa=4.68ppmHb=2.40ppmHc=1.10ppm去屏蔽效应当前第39页\共有125页\编于星期六\11点3、化合物的化学位移简单介绍①饱和烃-CH3:CH3=0.791.10ppm-CH2:CH2=0.981.54ppm-CH:CH=CH3+(0.50.6)ppmH=3.2~4.0ppmH=2.2~3.2ppmH=1.8ppmH=2.1ppmH=2~3ppm当前第40页\共有125页\编于星期六\11点②烯烃

端烯质子：H=4.8~5.0ppm内烯质子：H=5.1~5.7ppm与烯基，芳基共轭：H=4~7ppm③芳香烃

芳烃质子：H=6.5~8.0ppm供电子基团取代-OR，-NR2时：H=6.5~7.0ppm吸电子基团取代-COCH3，-CN，-NO2时：H=7.2~8.0ppm当前第41页\共有125页\编于星期六\11点-COOH：H=10~13ppm-OH：（醇）H=1.0~6.0ppm

（酚）H=4~12ppm-NH2：（脂肪）H=0.4~3.5ppm

（芳香）H=2.9~4.8ppm

（酰胺）H=9.0~10.2ppm-CHO：H=9~10ppm当前第42页\共有125页\编于星期六\11点常见结构单元化学位移范围当前第43页\共有125页\编于星期六\11点四、自旋偶合与自旋分裂1、峰的裂分现象乙醚的谱图（低分辨），高分辨——现代核磁共振仪，1H两个峰各分裂成四重峰和三重峰，这种情况叫做峰的裂分现象。低分辨NMR高分辨NMRCH3-CH2-O-CH2-CH3当前第44页\共有125页\编于星期六\11点2、自旋偶合与自旋裂分每类氢核不总表现为单峰，有时为多重峰。原因：相邻两个C原子氢核之间的自旋偶合（自旋干扰）；当前第45页\共有125页\编于星期六\11点自旋偶合：相邻两个C原子氢核自旋产生磁场的相互作用， （自旋原子核之间产生的相互干扰） 称自旋--自旋耦合（spin-spincoupling），简称自旋耦合。自旋分裂：由于自旋原子核产生磁场之间的干扰，原子核的NMR共振信号发生分裂的现象。例如：一个质子信号的分裂取决于邻近C原子上的质子数目。自旋偶合产生共振信号的裂分；自旋偶合是因，峰的裂分是果等性的H：：－CH3的三个H,不发生自旋耦合当前第46页\共有125页\编于星期六\11点3、自旋偶合当前第47页\共有125页\编于星期六\11点4、峰裂分数与峰面积

峰裂分数：符合n+1规律；主要由相邻碳原子上的质子数决定；各峰的系数符合二项式展开式的系数；峰面积：峰面积的积分与同类质子数成正比，仅能确定各类质子之间的相对比例。当前第48页\共有125页\编于星期六\11点峰裂分数1:11:3:3:11:11:2:1当前第49页\共有125页\编于星期六\11点峰裂分数1H核与n个不等价1H核相邻时，裂分峰数：（n+1)(n´+1)……个；(nb+1)(nc+1)(nd+1)=2×2×2=8Ha裂分为8重峰1:3:3:11:2:11:11:6:15:20:15:6:1当前第50页\共有125页\编于星期六\11点峰裂分数Ha裂分为多少重峰？01234JcaJbaJca

JbaHa裂分峰:(3+1)(2+1)=12实际Ha裂分峰:(5+1)=6强度比近似为：1:5:10:10:5:1当前第51页\共有125页\编于星期六\11点5、偶合常数

（J）（1）定义：相邻两个裂分峰之间的距离称为偶合常数(J)，其单位为Hz。 用来衡量偶合作用的大小。（2）裂分峰的化学位移奇数峰居中偶数峰也居中当前第52页\共有125页\编于星期六\11点（3）耦合常数性质①表示两个质子间相互干扰的强度。Jab的大小与磁场H0的强度无关，是由偶合分子本身结构决定。②相互干扰的两个质子，其偶合常数必然相等。根据偶合常数是否相等可以判断哪些质子之间发生了相互偶合。③在化学结构上等性的H（如：－CH3的三个H,其J=0)，相互之间不产生信号的自旋裂分。

④当两组峰（Ha和Hb)化学位移之差（△ν）与偶合常数（Jab)之比大于6（即△ν/J>6）时，符合（n+1)裂分规律和裂分峰面积的强度比。⑤当△ν接近或小于Jab时，出现复杂的多重峰。当前第53页\共有125页\编于星期六\11点6、峰面积与氢原子数目的关系揭示不同环境中H的化学位移和H的数目以乙醚的NMR谱为例两组峰的峰面积是不同的，衡量其面积之比是3：2，恰好是-CH3和-CH2基中氢原子数之比一组峰高2cm,一组峰高3cm，总高5cm.乙醚分子含10个氢原子，则10/5＝2（氢的数目/cm)，一组峰4个H，一组峰6个H.CH3-CH2-O-CH2-CH3

乙醚的NMR谱面积之比等于氢原子数之比CH3-CH2-O-CH2-CH3当前第54页\共有125页\编于星期六\11点衡量共振峰面积的方法积分曲线高度法，自动积分仪对峰面积进行自动积分。积分曲线的画法是由低场到高场，从积分曲线起点到终点的总高度与分子中全部氢原子的数目成比例。每一阶梯的高度表示引起该共振峰的氢原子数之比，其高度比可以用坐标纸方格数（或cm)表示。（目前计算机完成）乙醚的NMR谱当前第55页\共有125页\编于星期六\11点碳谱与氢谱的对比当前第56页\共有125页\编于星期六\11点五、生物学中的NMR1、核磁共振是测定蛋白质结构的主要技术，其特点如下：（1）接近生理条件的溶液中进行，所获取的结构信息更接近于生物体内情况。（2）不需制备蛋白质单晶。（3）对样品的要求也是比较严格的．例如。所研究的蛋白质不能太大，溶解性要好，稳定性要高，不降解不聚合，可进行同位素标记等等。（4）样品稳定性高，满足多维核磁共振长时间测定的要求当前第57页\共有125页\编于星期六\11点2、在生物学其它方面的应

用：

研究生物大分子及其复合物在溶液中的三维结构和功能；

研究动态的生物大分子之间以及与配基的相互作用；

研究生物大分子的动态行为；

固体NMR或液体NMR技术研究膜蛋白的结构与功能；

研究蛋白质折叠，折叠动力学；

用于药物筛选与设计；

研究代谢组学；

研究活细胞中的蛋白质—蛋白质相互作用；

核磁成像用于认知科学研究（直观观察）．当前第58页\共有125页\编于星期六\11点六、NMR蛋白质结构测定基本程序纯度：不应有铁及其它杂质、粘度要低、浓度：5-10%；5mg(1H),15-30mg(13C)；傅立叶变换-NMR需1mg溶剂：1H谱=四氯化碳(1H),、二硫化碳氘代溶剂：水（D2O

）、氯仿、丙酮、苯、二甲基亚砜的氘代物标样浓度（四甲基硅烷TMS）：1%样品→1D-2D-3D（一级和二级结构)→计算出三维结构→能量最小化优化→高分辨率三维结构1、基本程序当前第59页\共有125页\编于星期六\11点2、NMR详细步骤1.样品制备：将蛋白质溶于D2O或H2O中，相对分子质量大于6000的需要事先用15N或13C加以标记2.一维NMR实验：测定1HNMR谱图。用D2O交换以及做pH、温度的影响实验，以获取化学位移、耦合常数以及有关形成氢键等信息3.二维NMR实验：测定1H-1HCOSY等，以确定耦合体系，辨别氨基酸类型，进行序列识别，并根据NOE信息确定各种二级结构单元等。4.三维NMR实验：测定CBCA(CO)NH,CBCANH,HNCO,HNHA,HCCH-COSY,NOESY-TOCSY等的三维图谱，进一步确认各自旋体系5.四维NMR实验：测定13C/15N编辑的NOESY或13C/13C编辑的NOESY谱，对重叠严重的一些谱峰的NOE相关性进行分析

当前第60页\共有125页\编于星期六\11点本节小结核磁共振有关的概念、原理及应用。核磁共振仪的工作原理样品的测定程序和步骤了解蛋白质的NMR解析步骤当前第61页\共有125页\编于星期六\11点第四节质谱技术简单介绍概念和原理，在蛋白质组学中再详细介绍当前第62页\共有125页\编于星期六\11点一、概述当前第63页\共有125页\编于星期六\11点当前第64页\共有125页\编于星期六\11点进样系统离子源质量分析器检测器1.气体扩散2.直接进样3.气相色谱1.电子轰击2.化学电离3.场致电离4.激光1.单聚焦2.双聚焦3.飞行时间4.四极杆

质谱仪需要在高真空下工作：离子源（10-310-5Pa

）

质量分析器（10-6Pa

）1．大量氧会烧坏离子源的灯丝；2．用作加速离子的几千伏高压会引起放电；3．引起额外的离子－分子反应，改变裂解模型，谱图复杂化。一、质谱分析原理当前第65页\共有125页\编于星期六\11点电离室原理与结构仪器原理图原理与结构当前第66页\共有125页\编于星期六\11点质谱仪分析原理当前第67页\共有125页\编于星期六\11点当前第68页\共有125页\编于星期六\11点当前第69页\共有125页\编于星期六\11点当前第70页\共有125页\编于星期六\11点当前第71页\共有125页\编于星期六\11点当前第72页\共有125页\编于星期六\11点当前第73页\共有125页\编于星期六\11点当前第74页\共有125页\编于星期六\11点当前第75页\共有125页\编于星期六\11点当前第76页\共有125页\编于星期六\11点当前第77页\共有125页\编于星期六\11点当前第78页\共有125页\编于星期六\11点当前第79页\共有125页\编于星期六\11点当前第80页\共有125页\编于星期六\11点当前第81页\共有125页\编于星期六\11点当前第82页\共有125页\编于星期六\11点当前第83页\共有125页\编于星期六\11点当前第84页\共有125页\编于星期六\11点当前第85页\共有125页\编于星期六\11点当前第86页\共有125页\编于星期六\11点当前第87页\共有125页\编于星期六\11点当前第88页\共有125页\编于星期六\11点当前第89页\共有125页\编于星期六\11点当前第90页\共有125页\编于星期六\11点S/N≥10当前第91页\共有125页\编于星期六\11点二、分类按离子源电啧雾质谱(ESI)快原子轰击质谱(FAB)基质辅助激光解吸离子化质谱（MALDI）根据两个中心部件分类离子化源、质量分析器质量分析器当前第92页\共有125页\编于星期六\11点仪器内部结构三、联用仪器当前第93页\共有125页\编于星期六\11点联用仪器（THEGC/MSPROCESS）SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACD当前第94页\共有125页\编于星期六\11点分子离子峰

分子电离：丢失一个电子形成的离子所产生的峰。分子离子的质量与该化合物的分子量相等。

有机化合物分子离子峰的稳定性顺序：芳香化合物＞共轭链烯＞烯烃＞脂环化合物＞直链烷烃＞酮＞胺＞酯＞醚＞酸＞支链烷烃＞醇．当前第95页\共有125页\编于星期六\11点分子量测定肽谱测定肽、蛋白序列测定巯基和二硫键定位蛋白质翻译后修饰生物分子相互作用蛋白质组分析质谱技术在蛋白质结构分析中的应用当前第96页\共有125页\编于星期六\11点本节小结质谱分析的概念和原理质谱分析在蛋白质分析方面的应用当前第97页\共有125页\编于星期六\11点本节小结蛋白质序列分析方法和原理X衍射晶体分析及原理核磁共振原理及应用质谱分析技术当前第98页\共有125页\编于星期六\11点思考题在何时发现核磁共振现象，其研究材料是什么？什么是化学位移，化学位移表示方法有哪些？采用的相对标准是什么？为什么采用？化学位移与磁场屏蔽效应的关系如何？磁量子数（m)，弛豫过程，弛豫过程的主要方式核磁共振及其条件？核磁共振波谱仪主要组成和工作原理，实现核磁共振的两种方法？自旋偶合，为什么说自旋偶合是因，峰的裂分是果，偶合常数

（J），裂分峰的化学位移如何确定？耦合常数有哪些性质，具有和意义。举例说明峰面积与氢原子数目的关系。衡量共振峰面积的方法。核磁共振是测定蛋白质结构的主要技术，其特点是什么？什么是质谱分析，质谱仪的原理、组成和分类，举例说明。当前第99页\共有125页\编于星期六\11点当前第100页\共有125页\编于星期六\11点当前第101页\共有125页\编于星期六\11点当前第102页\共有125页\编于星期六\11点当前第103页\共有125页\编于星期六\11点磁等同与磁不等同

1.化学等价（化学位移等价）若分子中两个相同原子（或两个相同基团）处于相同的化学环境，其化学位移相同，它们是化学等价的。化学不等价例子：⑴对映异构体在手性溶剂中：两个CH3化学不等价在非手性溶剂中：两个CH3化学等价当前第104页\共有125页\编于星期六\11点⑵固定在环上CH2的两个氢化学不等价。⑶单键不能快速旋转，连于同一原子上的两个相同基化学不等价。⑷与手性碳相连的CH2的两个氢化学不等价。当前第105页\共有125页\编于星期六\11点分子中相同种类的核（或相同基团），不仅化学位移相同，而且还以相同的偶合常数与分子中其它的核相偶合，只表现一个偶合常数，这类核称为磁等同的核。磁等同例子：三个H核化学等同磁等同二个H核化学等同，磁等同二个F核化学等同，磁等同六个H核化学等同磁等同磁等同当前第106页\共有125页\编于星期六\11点两核（或基团）磁等同条件①化学等价（化学位移相同）②对组外任一个核具有相同的偶合常数（数值和键数）Ha，Hb化学等价，磁不等同。JHaFa≠JHbFaFa，Fb化学等价，磁不等同。磁不同等例子：

当前第107页\共有125页\编于星期六\11点化学位移表1当前第108页\共有125页\编于星期六\11点化学位移表2当前第109页\共有125页\编于星期六\11点偶合与弛豫13C-13C偶合的几率很小（13C天然丰度1.1%）；13C-1H偶合；偶合常数1JCH：100-250Hz；峰裂分；谱图复杂；去偶方法：(1)质子噪声去偶或宽带去偶(protonnoisedecouplingorboradbanddecoupling)：采用宽频带照射，使氢质子饱和；去偶使峰合并，强度增加(2)质子偏共振去偶：识别碳原子类型；弛豫：13C的弛豫比1H慢，可达数分钟；采用PFT-NMR可测定，提供空间位阻、各向异性、分子大小、形状等信息；当前第110页\共有125页\编于星期六\11点碳谱与氢谱的对比谱图去偶作用对比当前第111页\共有125页\编于星期六\11点碳谱与氢谱的对比当前第112页\共有125页\编于星期六\11点谱图去偶作用对比当前第113页\共有125页\编于星期六\11点谱图去偶作用对比当前第114页\共有125页\编于星期六\11点生物学中的NMR生物大分子的空间结构测定为结构生物学、功能基因组学和生物信息学等领域的研究提供重要的结构信息。核磁共振是测定蛋白质结构的主要技术，其主要优点在于：(1)NMR实验接近生理条件的溶液中进行，所获取的结构信息更接近于生物体内情况。(2)不需制备蛋白质单晶。但是，用

NMR技术测定蛋白质的空间结构。对样品的要求也是比较严格的．例如。所研究的蛋白质不能太大，溶解性要好，稳定性要高，不降解不聚合，可进行同位素标记等等。在结构生物学的研究中．制备能满足多维核磁共振长时间实验要求的高稳定的蛋白质

NMR样品是开展蛋白质分子空间结构测定工作的首要前提。当前第115页\共有125页\编于星期六\11点核磁技术不仅仅局限于结构测定，它在生物学中的应

用还包括如下方面：

研究生物大分子及其复合物在溶液中的三维结构和功能；

研究动态的生物大分子之问以及与配基的相互作用；

研究生物大分子的动态行为；

用固体核磁共振或液体核磁共振技术研究膜蛋白的结构与功能；

研究蛋白质折叠，折叠动力学；

用于药物筛选与设计；

研究代谢组学；

研究活细胞中的蛋白质一蛋白质相互作用；

核磁成像用于认知科学研究．当前第116页\共有125页\编于星期六\11点应用于膜蛋白结构研究的核磁方法主要有液体核磁共振固体核磁共振方法其中液体核磁共振方法主要针对膜蛋白／去污剂胶束复合物(应用去污剂胶束来模拟膜蛋白的磷脂双分子层环境)固体核磁共振方法则应用于膜蛋白／磷脂复合物在应用固体核磁共振方法研究膜蛋白三维结构时，又有两种不同的方法魔角旋转静态取向这两种固体核磁共振方法应用不同的手段，获取不同的结构信息，但是都能应用来进行膜蛋白在磷脂中的结构研究．当前第117页\共有125页\编于星期六\11点蛋白质同位素标记技术

蛋白质的同位素标记技术可以提高

NMR谱的灵敏度和分辨率。减小谱线线宽，从而减少谱峰重叠，简单谱图，而且能提高用NMR技术测定溶液构象的蛋白质的分子量上限。一般分子量小于

8kD的蛋白质可以不需进行同位素标记．使用1H-1H同核

2DNMR技术；分子量在

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