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文档简介
荧光定量实验设计及优化演示文稿当前第1页\共有27页\编于星期四\11点(优选)荧光定量实验设计及优化当前第2页\共有27页\编于星期四\11点33长度 16-24bases(引物)序列 不能有以下情况:任意2个引物或探针之间的序列互补引物或探针本身有二级结构连续的>GGG,引物的5’端有G引物3’端最后5个碱基有2个以上的G或C引物3’端最后1个碱基为AGC含量
40-60%GC
GC/AT分布大致均衡,C含量>G探针复性温度
65-70°C引物复性温度60-65°CPCR引物与探针当前第3页\共有27页\编于星期四\11点4标记
淬灭基团采用无荧光背景的如BHQ,不要用tamraPCR产物长度 50-150bpDesign primerdesignsoftware,选择序列保守区域如果保守区域太短,可以在引物中考虑引入LNA提高Tm
探针可以考虑引入LNA或改用MGB或自淬灭taqman探针简并引物或探针需要同时考虑多种情况下的Tm高低纯化与否
PAGE/HPLC
PCR引物与探针当前第4页\共有27页\编于星期四\11点5SNP的Taqman双色检测中,突变探针一般Fam标记相对定量分析中内参基因一般Hex标记(例如Roche的UPL相对定量解决方案)
对检测要求更高的建议Fam标记(灵敏度或者定量vs定性)
扩增效率较差的建议Fam标记
PCR引物与探针当前第5页\共有27页\编于星期四\11点6ReactionConditions
PrimersandProbesConcentrationRange(finalcon.)Primers: 0.1µM–1.0µMeachProbes: 0.1µM–0.5µMStandardConcentrations(finalconc.)Primers: 0.5µMeachProbes: 0.2µMExample:UniversalProbeLibraryassayHigherprimers/probeconcentrationsgivebettersignaltonoiseratio(higherfluorescencesignalintensitiy)OnlyminorinfluenceonCpwhenusedinmediumconcentrationranges当前第6页\共有27页\编于星期四\11点7PCR的建立与优化核酸纯化与逆转录PCR试剂体系引物、探针的设计当前第7页\共有27页\编于星期四\11点8建立新的PCR体系:
GeneralHints模板 -DNA或
cDNA为模板对照-NTC(notemplatecontrol)每个探针引物组合
-阳性对照
(如果可能)分析
-扩增:sensitivityandefficiencyofPCR(crossingpoints)-熔解曲线分析
(SYBRGreenIformat):检测引物二聚体或其它非特异性扩增凝胶电泳:验证非特异性扩增meltingcurve(杂交探针等模式):突变检测或亚型分析当前第8页\共有27页\编于星期四\11点9StandardConditionsinPCRMgCl2Concentration:2-5mM当前第9页\共有27页\编于星期四\11点10BasicOptimizationinPCRUseanytemplatenucleicacid(NA)suitableforPCR,sufficientlypurifiedandfreeofPCRinhibitorsTemplateConcentration: 建议测试多个稀释度
(最少2个梯度,10^2)genomicDNA 50ng-5pgplasmidDNA approx.106copies
RNA ≤500ngtotalRNAor100ngmRNAcDNA ≤50ngequivalentoftotalRNA,RTproductundiluted,1:10and1:100dilutionsNAStorageStorenucleicacidsinhighconcentrationsandaliquotsForlowtemplateconcentrations,usesiliconizedtubesandadd
carrierNA(10ng/µl),e.g.MS2RNA当前第10页\共有27页\编于星期四\11点11BasicOptimization:
MgCl2Titration
MgCl2Titration:2-5mMFormat:SYBRGreenILCFastStartDNAMaster当前第11页\共有27页\编于星期四\11点12BasicOptimization:
TemplateConcentration
模板浓度过高会抑制PCR
TemplateDNA
undilutedand1:10dilutionFormatSYBRGreenILIghtCycler®DNAMasterNTCsample1originalsample11:10sample2originalsample21:10当前第12页\共有27页\编于星期四\11点13SYBRGreenIFormat
PCRAnalysisExample
模板拷贝数越低,越容易出现引物二聚体QuantificationMeltingCurveAnalysis当前第13页\共有27页\编于星期四\11点14Optimization:
InfluenceofPCRInhibitors
PCR抑制物可通过适当稀释样品降低对其对PCR的影响NTCcDNAoriginalcDNA1:2cDNA1:4cDNA1:20TemplatecDNA
undiluted,1:2,1:4,1:20dilutionsFormatSYBRGreenILightCycler®DNAMaster当前第14页\共有27页\编于星期四\11点15FurtherOptimizationinPCR检测灵敏度和信号强度可以通过调整下列参数得以改进当前第15页\共有27页\编于星期四\11点16PCR的建立与优化核酸纯化与逆转录PCR试剂体系引物、探针的设计当前第16页\共有27页\编于星期四\11点AAAAAAAAAAAAtRNAmRNArRNARNase不同丰度组织名称样品量总RNA含量高丰度肝脏1mg2-4μg脾脏1mg心脏1mg中丰度大脑1mg0.05-2μg胚胎1mg肾脏1mg肺1mg低丰度膀胱1mg0-0.05μg骨1mg脂肪1mg高丰度成纤细胞1050.5-1μg人白细胞105细胞中RNA的种类和含量当前第17页\共有27页\编于星期四\11点“chaotropicsalts”inbindingbufferRoche手工提取RNA的试剂盒细胞和组织HighPureRNAIsolationKitHighPureRNATissueKitTriPureIsolationReagent甲醛固定石蜡包埋组织和石蜡包埋组织HighPureFFPERNAMicroKitHighPureRNAParaffinKit提取mRNAmRNAIsolationKitmRNACaptureKitHighPuremiRNAIsolationKit病毒RNAHighPureViralRNAKit*HighPureViralNucleicAcidKit当前第18页\共有27页\编于星期四\11点RNA操作注意事项RNA酶(Rnase)是导致RNA降解最主要的物质。此酶非常稳定,在一些极端的条件下只可暂时失活,但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的Rnase完全失活。1.Rnase广泛存在于人的皮肤上,因此制备RNA时必须戴手套2.
Rnase可存在于取液器中,因此设置RNA专用pipettor,或者采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,可基本达到要求。3.塑料制品、玻璃和金属物品的处理
a.尽量已标明RNase-free的塑料制品,如没有开封使用过,通常不必处理,
处理步骤:在浸泡塑料制品的容器中,加入终浓度为0.05%~0.1%的DEPC-H2O,室温放置过夜,第二天将DEPC-H2O倒出,高温高压蒸汽灭菌至少30分钟。b.玻璃和金属物品250℃烘烤3小时以上或者180℃烘烤8小时以上当前第19页\共有27页\编于星期四\11点RNA操作注意事项
选择新鲜血液,不得超过4小时
选择新鲜、生长旺盛的组织
选择处于生长旺盛时期的细胞可将新鲜血液先进行红细胞裂解,得到白细胞,然后加入一定量的细胞裂解液/TRNzol,-70℃保存较长时间
推荐使用专门的RNA样品储存液进行储存
去掉培养基,加入一定量RNA提取试剂,-70℃保存较长时间RNA应分装后冻存于-70冰箱,样品不能反复冻融长期保持:RNA提取步骤进行到在70%乙醇洗涤时,停止实验,让RNA保存于70%乙醇中当前第20页\共有27页\编于星期四\11点RNA的评价与鉴定纯度(OD260/OD280
):OD260/OD280<1.9说明有蛋白污染OD260/OD280=1.9~2.1说明纯度很好OD260/OD280>2.1说明有部分降解得率(OD260)Yield=OD260×稀释倍数×40ng/ul紫外分光光度计检测当前第21页\共有27页\编于星期四\11点1%琼脂糖,6V/cm,15min,上样1~3ul
电泳检测M12M12DNA残留蛋白残留RNA的评价与鉴定当前第22页\共有27页\编于星期四\11点23RT反应主要组成成分ReverseTranscriptase
AMVReverseTranscriptase(AvianMyeloblastosisVirus)48–55°C
M-MuLVReverseTranscriptase(MoloneyMurineLeukaemia)37–42°CTranscriptorReverseTranscriptase(recombinant,E.coli.)upto65°C引物(OligodTorRandomPrimersorGeneSpecificPrimers)Sequence-specificprimersRandomHexamerPrimersandanchoredoligo(dT)NRNA模板当前第23页\共有27页\编于星期四\11点24TranscriptorReverseTranscriptaseTranscriptorreversetranscriptaseAbilitytosynthesizefragmentsupto14kb(fulllengthcDNA)Reversetranscriptionofdifficulttemplates(e.g.,GC-richRNAtemplates)duetothermostabilityupto65°CRNaseHactivity:degradesRNAinRNA:DNAhybridTranscriptorRTInvitrogenSuperscriptIIInvitrogenSuperscriptIIIMaxProductsize14kb12.3kb12.3kbReactiontime30mins50mins30-60minReactiontemperature42-65℃42℃50-55℃Sensitivity50pgtotalRNA1ngtotalRNA10pgRNAGC-richtemplateYESNoinfoNoinfoRNaseHactivityYESReducedReduced当前第24页\共有27页\编于星期四\11点25一步法RT-PCR
VS.二步法RT-PCR2-stepRT-PCRreversetranscriptionandPCR-amplificationseparately1-stepRT-PCRreversetranscriptionandPCR-amplificationinonereaction
everythingforreversetranscriptioneverythingforPCR108copiesofthesequenceofinteresteverythingforreversetranscriptionNewlysynthesizedcDNAcDNAtogetherwitheverythingforPCR108copiesofthesequenceofinterest当前第25页\共有27页\编于星期四\11点26一步法和二步法RT-PCR优点比较一步法RT-PCR的优点二步法RT-PCR的优点降低污染的风险SingletubeReactionNotransfer/openingrequiredAutomationispossible可以分别优化RT和PCR反应条件Efficientandaccurateamplification增加了灵敏度和特异性Sequence
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