菌种的选育和保存

菌种的选育和保存第一页，共七十页，编辑于2023年，星期一抗生素生产基于微生物本体可以产生抗生素，依赖于微生物机体在反应器内的生长繁殖及代谢过程来合成抗生素，通过分离纯化进行提取精制，并最终制剂成型来实现药物生产的过程。第二页，共七十页，编辑于2023年，星期一制种：选取改良合适的菌种发酵：繁殖得到大量的菌体提取：从菌体中提取抗生素第三页，共七十页，编辑于2023年，星期一

菌种选育理论与技术利用工业微生物发酵生产的过程中，决定生产水平高低最主要的有三个方面的因素：生产菌种，发酵工艺和后提取工艺。其中最重要的是生产菌种。菌种选育的最初目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求。第四页，共七十页，编辑于2023年，星期一产生抗生素的优良菌种应具备条件1.产量高；2.生长快；3.性能稳定；4.容易培养。第五页，共七十页，编辑于2023年，星期一菌种选育：根据菌种自然变异而进行的自然选育，以及用人工方法引起菌种变异或形成新的杂种，再按照工业生产的要求用随机方法或理性化方法进行筛选，获得目的变种。第一节菌种选育第六页，共七十页，编辑于2023年，星期一菌种选育的目的第七页，共七十页，编辑于2023年，星期一遗传—DNA的半保留复制，保持物种的相对稳定性变异—DNA4种核苷酸碱基的化学结构、顺序或数目发生变化，导致生物体表型的改变，通常称为基因突变，这种表型改变可稳定地一代一代传递下去。促使新性状的产生、获得新的优良品种一、微生物的遗传和变异

第八页，共七十页，编辑于2023年，星期一遗传型变异：在遗传物质水平上发生了改变，从而引起某些相应性状发生改变的特性

变异性表型变异：微生物在生活条件发生改变时，发生暂时的形态、生理等特性的改变，但随着环境条件的复原，它们又恢复了原有的特性遗传变异：1、突变

2、重组突变：1、自发突变（10-7）

2、诱发突变（10-4），为育种主要手段。第九页，共七十页，编辑于2023年，星期一（一）基因突变基因突变是指遗传物质（DNA）中的核苷酸发生了稳定的可遗传的变化，主要包括点突变和染色体畸变两大类。

1、点突变是由于DNA链上的一对或少数几对碱基发生改变引起的。

2、染色体畸变是指DNA大段变化（损伤）的现象，主要包括染色体结构上的变化和染色体数目的变化。（二）基因重组

指两个或多个不同性状个体的遗传基因转移到一个体细胞内，经重新组合后，造成菌种变异，形成新的遗传型个体。

第十页，共七十页，编辑于2023年，星期一二、菌种选育的意义1、提高单位产量和改进产品质量青霉素发酵：2g/ml→250g/ml→1000g/ml→70000g/ml1928年1943年1945年现在产黄色色素的原始菌种产黄青霉WisQ-176，产生黄色色素，提炼过程中难以去除，影响产品质量，在菌种选育过程中获得无色素突变型菌株，解决了产品质量问题。第十一页，共七十页，编辑于2023年，星期一2、改变菌种的某些遗传性状，使之更适合于工业生产如选育抗噬菌体的菌株、能利用廉价的发酵原料或需氧量较小的菌株、改变菌种代谢产物的组成配比等。第十二页，共七十页，编辑于2023年，星期一二、菌种选育的经典方法

1、自然选育是一种纯种选育的方法。它利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离，筛选排除衰变型菌落，从中选择维持原有生产水平的菌株。自发突变机制：自发突变产生原因：1、多因素低剂量长期综合诱变的结果；2、自然界存在低浓度的诱变物质；3、微生物自身产生的诱变物质（咖啡碱、过氧化氢等）4、碱基互变异构效应。第十三页，共七十页，编辑于2023年，星期一二、菌种选育的经典方法:自然选育特点：（1）能纯化、复壮菌种，稳定生产，提高平均生产水平。（2）难以选育高产突变菌株，不能使生产水平大幅度提高。第十四页，共七十页，编辑于2023年，星期一2、诱变育种诱变育种是指人工有意识地将生物体暴露于物理的、化学的或生物的一种或多种诱变因子中，促使生物体发生突变，进而从突变体中筛选具有优良性状的突变株的过程。特点：与自然选育比较，由于引进了诱变剂处理，因而加速了菌种突变的频率，扩大了变异的幅度，从而提高了获得优良特性的突变株的几率。第十五页，共七十页，编辑于2023年，星期一

物理诱变剂：紫外线、x射线、Y射线、快中子、β射线、超声波、激光诱变剂化学诱变剂：氮芥、乙烯亚胺、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、亚硝基甲基脲、亚硝酸生物诱变剂：噬菌体、转座因子第十六页，共七十页，编辑于2023年，星期一形成胸腺嘧啶二聚体，影响DNA复制物理诱变剂CTAGGATCCTAGGATC紫外线第十七页，共七十页，编辑于2023年，星期一是一些能和DNA起作用，改变其结构，从而引起遗传变异的化学物质。如烷化剂、亚硝基类化合物，碱基类似物（5-溴尿嘧啶），吖啶类化合物。烷化鸟嘌呤与胸腺嘧啶错误配对化学诱变剂第十八页，共七十页，编辑于2023年，星期一1).烷化剂一类重要的诱变剂，可引起碱基的错误配对而引起的多种类型突变，如转换、颠换、缺失和移码诱变，以及染色体畸变。使用最为广泛的是亚硝基胍（NTG）和乙基磺酸乙酯（EMS），主要因为它们杀死率相对较低，而获得的突变频率较高。2).嵌合剂常用有哑啶类染料、溴乙锭、ICR等化合物。能引起移码突变。第十九页，共七十页，编辑于2023年，星期一3).碱基类似物分子结构与DNA上的碱基相似的化合物称为碱基类似物。如5-溴尿嘧啶（5-BU）、6-氨基嘌呤等。这些化合物干扰了DNA分子内酮式与烯醇式的平衡。它们掺入DNA分子，使其出现烯醇的比例增加。分别形成AT向GC和GC向AT的转换。4).亚硝酸主要是通过氧化脱氨基作用脱去DNA碱基上的氨基，如C氧化脱氨基成为U，A脱氨成为次黄嘌呤等。第二十页，共七十页，编辑于2023年，星期一第二十一页，共七十页，编辑于2023年，星期一5).抗生素丝裂霉素C、放线菌素D等抗癌抗生素作用于DNA合成，从而干扰细胞正常分裂。3、生物诱变剂噬菌体：溶源性噬菌体是一种遗传信息的传递者，因而人们把噬菌体看作是一种诱变剂。在选育抗噬菌体菌种时，噬菌体显示出明显的诱变效应。转座因子：转座因子是一类能够转移位置的遗传因子。第二十二页，共七十页，编辑于2023年，星期一诱变剂的选择及影响诱变效果的因素（一）、诱变剂的选择诱变剂作用：1、提高突变频率；2、扩大变异产生的幅度。合适剂量：凡是既能增加变异幅度，又能促使变异向正突变范围移动的剂量就是合适的剂量。一般认为高剂量（致死率在90%以上）引起的变异范围大，变株比较多，适用于单位产量较低的菌株，而长期用于工业生产经过多次诱变选育的菌株，则宜用中等剂量（致死率为70%~80%），甚至更低。并且一般认为低剂量可以提高正变率。第二十三页，共七十页，编辑于2023年，星期一（二）影响诱变效果的因素1、选择合适的出发菌株即用来育种的原始菌株，多采用生产能力高，具有良好性状的菌株作为亲本。用作诱变的出发菌株必须产量高，生长速度快，营养要求低，产生孢子多，对诱变剂的敏感性大，变异幅度大。第二十四页，共七十页，编辑于2023年，星期一2、采用分散状态的孢子悬浮液处理诱变剂所处理的微生物一般要求呈悬浮状态，并使细胞尽量处于分散状态。有利于细胞均匀接触诱变剂，也可以部分避免出现不纯菌落。3、采用单核细胞处理诱变剂所处理的细胞中的细胞核愈少愈好，最好是处理单核细胞（用玻璃珠打散）。如处理霉菌或放线菌，则尽量采用孢子进行处理。如是芽孢杆菌，则处理芽孢。4、注意微生物的生理状态一般对数期的细菌对诱变最为敏感。让霉菌或放线菌的分生孢子稍稍萌发，可以提高诱变效果。第二十五页，共七十页，编辑于2023年，星期一5、适宜的诱变方法两种或多种诱变剂先后使用；同一诱变剂重复使用；两种或多种诱变剂同时使用。诱变剂的复合处理常常呈现一定的协同效应。同时,抗生素产量是数量性状,是微效多基因作用的结果,即抗生素的增产是一种累积效应。因此,这种复合诱变应多次循环进行,诱变效果会更理想。第二十六页，共七十页，编辑于2023年，星期一四、突变株的筛选1、随机筛选指菌种经过诱变处理后，仅凭经验随机筛选菌落。（1）肉眼观察法排除低产菌落：经验性（2）琼脂块法排除低产菌落：春日霉素的筛选，提高效率，稳定性差（3）直接摇瓶筛选法：准确性高，但工作量大，效率低第二十七页，共七十页，编辑于2023年，星期一肉眼观察法排除低产菌落：比如，在四环素突变株筛选过程中人们发现，突变株的菌落形态与四环素发酵效价之间存在有一定的对应关系。即菌落呈圆形或梅花形、表面粗糙、孢子鼠灰色或深灰色、孢子量大、丰满且菌落较小的突变株,往往是发酵效价得以提高的表现。

第二十八页，共七十页，编辑于2023年，星期一又如在康乐霉素C产生菌在紫外线处理过程中发现了自然分离过程中没有的形态变异,对各种菌落形态与产量的正变关系进行了统计(以抑菌圈比出发实验菌株的抑菌圈大10%以上的菌株为正变菌株)。菌落形态有草帽型、馒头型、中间开花型及小菌落。草帽型是最常见的,而中间开花的与之形态相近,只不过草帽型中间是一个尖,而开花型中间裂开花。小菌落是紫外处理出现的少量菌落,而自然分离中未发现。草帽型有稳定的高正变率。第二十九页，共七十页，编辑于2023年，星期一2、半理性化筛选随着人们对抗生素生物合成途径及代谢调控机制的了解不断深入，产生了推理选育技术。指运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高产突变株的筛选方法。第三十页，共七十页，编辑于2023年，星期一如氯霉素的生物合成过程中，芳基胺合成酶为关键酶，当氯霉素浓度到达100u/ml时，可完全抑制该酶的合成。因此，可以考虑选育解除终端产物反馈调节的突变株。类似还有：新生霉素影响产生菌的琥珀酸脱氢酶活力、制霉菌素影响醛缩酶活力，瑞斯托霉素影响磷酸甘油醛脱氢酶活力等。第三十一页，共七十页，编辑于2023年，星期一在青霉素发酵过程中加入苯乙酸或苯氧乙酸作为前体，分别能合成青霉素G和V。但培养基中过量的前体有较强毒性，且可抑制终产物生物合成。选育对毒性前体的抗性突变株，可消除反馈抑制作用。又如氯化物是灰黄霉素发酵前体，选用耐氯化物的变株，提高灰黄霉素产量。第三十二页，共七十页，编辑于2023年，星期一三、现代菌种选育技术1、杂交育种：

指两个基因型不同的菌株通过接合使遗传物质重新组合，再从中分离，筛选出具有新性状的菌株。优点：能集中位于不同品种中的优良性状。缺点：只能利用已有的基因组，并不能产生新的基因。杂交进程缓慢，过程繁琐。第三十三页，共七十页，编辑于2023年，星期一2、原生质体融合

用脱壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体，再用融合剂（如聚乙二醇）促进原生质体发生融合，从而获得融合子，这一技术叫原生质体融合。

细胞（A+B—）

细胞（A—B+）

脱壁处理

脱壁处理

原生质体（A+B—）

原生质体（A—B+）

混合

加融合剂

原生质体融合

涂平板（原生质体再生）

形成菌落

检出重组子菌落（A+B+）

第三十四页，共七十页，编辑于2023年，星期一3、基因工程（基因拼接技术或DNA重组技术）是指按照人的意志，将某一生物体(供体)的遗传信息在体外经人工与载体相接(重组)，构成重组DNA分子，然后转入另一生物体(受体)细胞中，使被引进的外源DNA片段在后者内部得以表达和遗传。第三十五页，共七十页，编辑于2023年，星期一自20世纪，80年代以来，对链霉素抗生素产生菌分子遗传学的研究取得较大进展。对多种抗生素的生物合成基因进行了不同程度的研究。比如：1、增加限速酶基因拷贝数，提高菌种生产能力限速步骤：在抗生素合成过程中，某些步骤对整个生物合成是至关重要的。限速酶：控制限速步骤的酶叫限速酶，通过增加限速酶基因的剂量，可能会缓解限速酶引起的“瓶颈”效应。如构建基因工程菌，将编码限速酶的基因克隆至载体，转化生产菌株，可筛得高产菌株。第三十六页，共七十页，编辑于2023年，星期一2、引入抗性基因和调节基因，增加抗生素单位产量许多抗生素生物合成基因经常与菌种对自身抗生素耐药基因连锁存在，因此可利用高拷贝质粒的基因剂量，提高菌种对自身抗生素的抗性，可提高抗生素产量。另外，调节基因在抗生素的生物合成中也起很重要的作用，增加正调节基因的拷贝数也能大幅度地提高次级代谢物的合成能力。第三十七页，共七十页，编辑于2023年，星期一3、引入血红蛋白基因，改善微生物的工业状况70年代末在专性好氧菌透明颤菌(Vit-reoscilla)中发现了血红蛋白(VHb),这是迄今在原核生物中发现的唯一一种血红蛋白。对VHb的功能研究表明,它作为一个氧气携带者,能促进氧气扩散到细胞末端氧化酶上,使细胞在贫氧状态下也能很好地生长。第三十八页，共七十页，编辑于2023年，星期一可将Vgb通过质粒转入变青链霉菌和天蓝色链霉菌中,在限氧条件下不仅使菌体生长量增加,还使其放线紫红素产量提高。也可将Vgb引入产黄顶头孢霉菌及产黄青霉菌中,限氧时VHb在前者的表达量较高,而且头孢菌素C的产量比对照菌株提高5倍。但这些实验仅在“限氧”这个特定条件下进行，而在工业发酵上，它的表达量很低，没有显示出产量增加优势，还有待进一步深入研究。第三十九页，共七十页，编辑于2023年，星期一菌种的退化

退化：连续传代基因突变

环境不良污染杂菌生产能力下降抵抗不良环境条件能力减弱第四十页，共七十页，编辑于2023年，星期一第二节菌种保藏

定义：将有用的微生物以特定培养形态在特定的环境条件下存放，以保持菌种的存活、纯粹和遗传性状的稳定。条件及原理：

1.

低营养

2.

干燥

3.隔氧

4.低温降低代谢速率或使细胞处于休眠状态第四十一页，共七十页，编辑于2023年，星期一一、定期移植保藏法

（斜面低温保藏法）1．原理制造低温环境，降低菌种的新陈代谢活动能力。2、方法将菌种接种于所要求的培养基上、置最适温度下培养，待得到健壮的菌体后，放在4℃左右，湿度小于70％的条件下保藏．每间隔一定时间重新移植培养1次。第四十二页，共七十页，编辑于2023年，星期一3、特点（1）此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏，一般可保存1～6个月左右。（2）优点：简便易行，容易推广，存活率高；缺点：菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。第四十三页，共七十页，编辑于2023年，星期一（二）石蜡油封藏法1、原理用液体石蜡防止或减少培养基内水分蒸发，隔绝培养物与氧的接触，降低微生物的代谢活动，推迟细胞老化，延长保存时间。2、方法在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。第四十四页，共七十页，编辑于2023年，星期一3、特点（1）此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏，一般可保存1～2年左右。石蜡油管的转接和搬运不方便。（2）不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。第四十五页，共七十页，编辑于2023年，星期一三、砂土管保藏法1、原理低温、干燥、隔氧和无营养物2、方法将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例分装于小试管中，砂土的高度约1cm，121℃蒸汽灭菌1～1.5h，间歇灭菌3次。50℃烘干后经检查无误后备用。将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约2～4h，用火焰熔封管口（或用石蜡封口），置于干燥器中，在室温或4℃冰箱内保藏。第四十六页，共七十页，编辑于2023年，星期一3、特点（1）适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的细菌及酵母则不适用。（2）保藏期较长，约1～10年。效果较好，且微生物移接方便，经济简便。第四十七页，共七十页，编辑于2023年，星期一四、麸皮保藏法1、原理以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然后在低温干燥条件下保存。2、方法将麸皮与水以一定的比例拌匀，装量为试管体积2/5，湿热灭菌后经冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔封，再保藏，则效果更好。第四十八页，共七十页，编辑于2023年，星期一3、特点（1）此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏期在1年以上。（2）操作简单、经济实惠，工厂较多采用。第四十九页，共七十页，编辑于2023年，星期一五、冷冻真空干燥保藏法（冻干法）1、原理在较低的温度下（一15℃以下），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。经过冷冻干燥的微生物的生长和代谢活动处于极低水平，不易发生变异或死亡，因此菌种可以保存很长时间。2、方法将准备保存的新鲜斜面菌种，在无菌条件下，装入灭菌的保护剂（常用脱脂牛奶和血清），制成菌悬液，再用无菌带橡皮头的滴管将菌悬液分装到准备好的安瓿管中，-35℃下预冻15min一2h，然后进行真空干燥，最后将试管真空熔封，低温避光保存。第五十页，共七十页，编辑于2023年，星期一3、特点（1）此法适用于各大类微生物。（2）此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有保护剂，保藏期一般长达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。（3）该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。第五十一页，共七十页，编辑于2023年，星期一六、液氮超低温保藏法1、原理微生物在－130℃的低温下，所有的代谢活动暂时停止而生命延续，微生物菌种得以长期保存。可通过加入保护剂来降低细胞内溶液的冰点，减少冰晶对细胞的伤害。

2、方法取合适的培养物，以5～10％的甘油或二甲亚砜制成孢子悬液或菌悬液。将此悬液注入无菌的安瓿管或聚丙烯小管内，密封，在液氮超低温（－196℃）下保藏。第五十二页，共七十页，编辑于2023年，星期一3、特点（1）适用于各种微生物菌种的保藏。（2）保藏期一般可达到15年以上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。（3）优点：操作简便、高效，且可使用各种培养形式的微生物进行保藏。缺点：需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。第五十三页，共七十页，编辑于2023年，星期一菌种保藏机构的简介菌种是一个国家的重要生物资源，所以菌种保藏是一项重要的菌物学工作。随着科技的进步和生产的发展，对菌物资源的利用正在不断扩大，所以菌种保藏工作显得更加重要。为此，在一些发达国家都设有相应的菌种保藏机构。其任务是广泛收集实验室和生产菌种，将它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不乱和便于研究、交换、使用的目的。第五十四页，共七十页，编辑于2023年，星期一菌种保藏机构ATCC（美国典型菌种保藏中心）CMCC(中国医学微生物菌种保藏管理中心)NBRC(日本技术评价研究所生物资源中心)第五十五页，共七十页，编辑于2023年，星期一第五节生产菌种的扩大培养（种子制备）一、定义种子制备是抗生素发酵生产的第一道工序。种子制备：利用生产菌种，在一定的条件下，经过扩大繁殖，成为具有一定质量和数量的纯种，供给抗生素生产使用。种子制备：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。第五十六页，共七十页，编辑于2023年，星期一第五节生产菌种的扩大培养（种子制备）一、定义种子制备：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。第五十七页，共七十页，编辑于2023年，星期一作为种子的准则：

菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；生理形状稳定；菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；无杂菌污染；保持稳定的生产能力。

第五十八页，共七十页，编辑于2023年，星期一

包括三个过程：1、孢子制备：生产大量孢子2、摇瓶种子制备：生产大量种子菌丝某些抗生素产生菌的孢子发芽和菌丝繁殖速度较缓慢，为了缩短种子罐培养周期和稳定种子质量，将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进罐，这就是所谓的摇瓶种子。3、种子罐种子制备种子制备是指孢于悬浮液或摇瓶种子接人种子罐后，在罐中繁殖成为大量菌丝的过程，从而缩短发酵罐繁殖苗丝的时间，增加合成抗生素的时间，种子罐种子经移植到发酵罐后，进一步繁越并产生抗生索。二、种子的制备过程第五十九页，共七十页，编辑于2023年，星期一二、种子的制备过程第六十页，共七十页，编辑于2023年，星期一1、实验室种子制备实验室种子的制备一般采用两种方式：孢子进罐法、摇瓶菌丝进罐法孢子进罐法对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。如：细菌、霉菌、一些放线菌（四环素、土霉素产生菌）等菌种第六十一页，共七十页，编辑于2023年，星期一摇瓶菌丝进罐法对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。如链霉素产生菌第六十二页，共七十页，编辑于2023年，星期一2、生产车间种子制备实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，在罐中繁殖成大量菌丝的过程。（1）种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于：菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；所采用发酵罐的容积第六十三页，共七十页，编辑于2023年，星期一如青霉菌，三级发酵孢子悬浮液→一级种子罐（27˚C,40小时孢子发芽，产生菌丝）→二级种子罐（27˚C,10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐