酶工程习题答案

1、 第一章 绪论一. 名词解释酶工程:酶的生产、改性与应用的技术过程。转换数：每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数，是酶催化效率的一个指标。催化周期：转换数的倒数，即酶进行一次催化所需时间，单位为毫秒或微秒。比活力：游离酶的比活力指每毫克酶蛋白或核酶RNA所具有的酶活力单位数，固定化酶的比活力指每克干固定化酶所具有的酶活力单位数。酶活力：指酶催化化学反应的能力，其衡量的标准是酶促反应速度酶活力的国际单位：在特定条件下，每1min催化1mol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位。异构酶：催化分子内部基团位置或构象转换的酶。变构酶：活性受别构调节物调控的酶。核酶：既可以催化酶分子本身也可以

2、催化其他分子进行反应的具有催化作用的RNA。抗体酶：一类具有催化功能的抗体。竞争性抑制：指抑制剂和底物竞争与酶分子结合而引起的抑制作用。反竞争性抑制：在底物与酶分子结合生成中间复合物后，抑制剂再与中间复合物结合而引起的抑制作用。非竞争性抑制：指抑制剂与底物分别与酶分子上的不同位点结合而引起酶活性降低的抑制作用。酶结合效率：又称酶的固定化率，指酶与载体结合的百分率。酶活力回收率：指固定化酶的总活力与用于固定化的总酶活力的百分率。固定化酶的相对酶活力：具有相同酶蛋白（或核酶）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值。二填空 1.催化； 2.绝对专一性、相对专一性、立体结构专一性； 3.底物浓度、酶浓度、

3、温度、PH、抑制剂、激活剂； 4.蛋白类酶、核酸类酶； 5.自我剪切酶、自我剪接酶； 6.RNA剪切酶、DNA剪切酶、多糖剪接酶、多肽剪切酶、氨基酸酯剪切酶、多功能R酶； 7.震荡测定法、酶柱测定法、连续测定法； 8.每克干固定化酶； 9.提取分离法、生物合成法、化学合成法。三判断题 1. 分子间催化的R酶中有许多酶的底物并非RNA，例如DNA剪切酶的底物为DNA； 2. 它还可以作用于自身RNA; 3. 它可以有多种底物，如DNA、RNA、多糖等； 4. 酶的化学本质是蛋白质和RNA。四简答题1. 简述酶的研究简史。答案：人们对酶的认识起源于生产与生活实践。夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。公元

4、前12世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。西方国家19世纪对酿酒发酵过程进行了大量研究。直到1897年，德国巴克纳Buchner兄弟用石英砂磨碎酵母细胞，制备了不含酵母细胞的抽提液，并证明此不含细胞的酵母提取液也能使糖发酵，说明发酵与细胞的活动无关。从而说明了发酵是酶作用的化学本质，为此Buchner获得了1911年诺贝尔化学奖。1896年,日本的高峰让吉首先从米曲霉中制得高峰淀粉酶,用作消化剂,开创了有目的的进行酶生产和应用的先例。1878年, 给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这个字来自希腊文，其意思“在酵母中”。后来对酶的作用机理及酶的本质做

5、了深入研究，1930年，证实酶是一种蛋白质；80年代初发现了具有催化功能的RNA核酶(ribozyme)，这一发现打破了酶是蛋白质的传统观念，开辟了酶学研究的新领域，现已鉴定出4000多种酶，数百种酶已得到结晶，而且每年都有新酶被发现。2. 简述酶工程的发展概况。答案：酶工程的发展包括四个阶段:(1)酶的简单应用。(2)固定化酶的应用。(3)固定化酶系统和固定化活细胞技术联合。(4)新的生物工程技术应用于酶工程。3. 简要回答酶的催化特点。答案：（1）易失活。高温、强碱、强酸、重金属盐可导致失活。（2）酶促反应具有极高的效率。酶的催化效率通常比非催化反应高1081020倍，比一般催化剂高107

6、1013倍。（3）酶促反应具有高度的专一性。（4）酶活性可调节。（5）反应条件温和。常温、常压，中性pH环境。4. 简要回答影响酶催化作用的因素。答案：（1）底物浓度。（2）酶浓度。（3）温度。（4）ph。（5）抑制剂。（6）激活剂。5. 简要回答米氏方程的意义。答案：1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelis equation)。这一学说的提出对酶反应机制的研究是一个重要的突破。6. 简述酶工程的研究内容及主要任务。答案：酶的生产与应用的技术过程称为酶工程，其主要内容包括微生物发酵产酶、动植物细胞培养产

7、酶、酶的提取和分离纯化、酶细胞原生质的固定化、酶反应器和酶的应用、酶非水相催化、酶分子修饰、酶的定向进化。7. 举例说明酶活力的测定在酶的研究、生产和应用过程中的重要性。答案：酶活力是指在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度（一般测初速度）。 酶促反应速度是指单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。单位：浓度/单位时间酶的活力单位（U） 国际单位（IU单位）：在最适反应条件下，每分钟催化1umol底物转化为产物所需的酶量，称一个国际单位（IU），1 IU = 1umol /min 国际单位（Katal, Kat单位）： 在最适反应条件下，每秒钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量，称K

8、at单位。1 Kat=60 X 106 IU酶活力的测定方法：分光光度法；荧光法；同位素法；电化学法。 8试述酶工程的发展概况与前景。答案：1908年,德国的罗姆制得胰酶,用于皮革的软化。1908年,法国的波伊登(Boidin)制备了细菌淀粉酶,应用于纺织品的退浆。1911年,美国的华勒斯坦(Wallestein)制得木瓜蛋白酶,用于除去啤酒中的蛋白质浑浊。此后,酶的生产和应用逐步发展。然而在50年代以前停留在从微生物，动物或植物中提取酶,加以利用阶段.由于当时生产力落后,生产工艺较繁杂,难以进行大规模工业化生产。1949年,用液体深层培养法进行细菌淀粉酶的发酵生产,揭开了近代酶工业的序幕。5

9、0年代以后,随着生化工程的发展,大多数酶制剂的生产已转向微生物流体深层发酵的方法。酶的应用越来越广泛。1953年德国科学家首先将聚氨基苯乙烯树脂与淀粉酶,胃蛋白酶,羧肽酶和核糖核酸酶等结合,制成了固定化酶。60年代，是固定化酶技术迅速发展的时期。1969年,日本的千烟一郎首次在工业上应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸。出现了“酶工程”这个名词来代表有效利用酶的科学技术领域。1971年第一届国际酶工程学术会议在美国召开,当时的主题即是固定化酶，进一步开展了对微生物细胞固定化的研究。1973年,千烟一郎首次利用固定化的大肠杆菌细胞生产L-天冬氨酸。1978年,日本的铃木等固定化细胞生

10、产-淀粉酶研究成功。70年代是固定化细胞技术取得进展的时期.80年代，固定化细胞已能用于生产胞外酶。在酶的固定化技术发展的同时,酶分子修饰技术也取得了进展。60年代，用小分子化合物修饰酶分子侧链基团,使酶性质发生改变;70年代,修饰剂的选用、修饰方法上又有了新的发展。此外,对抗体酶,人工酶,模拟酶等方面,以及酶的应用技术研究,在近20年均取得了较大进展,使酶工程不断向广度和深度发展,显示出广阔而诱人的前景。9. Payen和Person、Buchner兄弟、Sumner、Fisher、Koshland、Henri、Michaelis和Menten、Jacob和Monod、Cech和Altmam

11、及千佃一郎对酶学的主要贡献是什么？答案：1833年，Payen和Person从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀得到一种对热不稳定的活性物质，它可促进淀粉水解成可溶性糖。他们把这种物质称为淀粉酶制剂。 1896年，德国学者Buchner兄弟用酵母提取液实现发酵，证明发酵过程并不需要完整细胞，而是可以离开细胞的生命活动而存在。他把这种能发酵的蛋白质成分称为酒化酶(eymase)。一般认为酶学研究始于Buchner的这一发现。此项发现促进了酶的分离和对其理化性质的探讨，也促进了对有关各种活动中酶系统的研究。 1926年，Sumner从刀豆中得到脲酶结晶，提出酶本身就是一种蛋白质。 1894年Fischer

12、提出酶发生作用的“锁和钥匙”的模型。 20世纪5060年代，Koshland提出“诱导契合”理论，以解释酶的催化理论和专一性。 1902年，Henri提出中间产物学说。 1913年，Michaelis和Menton提出酶促反应动力学原理米氏方程。这一学说的提出对酶反应机制的研究是一个重要的突破。 1960年，Jacob 和 Monod提出操纵子学说。 1982年，Thomas R.Cech等人发现四膜虫细胞的26S rRNA前体具有自我剪接功能，将这种具有催化活性的天然RNA称为核酶Ribozyme。1983年，Altman等人发现核糖核酸酶P的RNA组分具有加工tRNA前体的催化功能。而RN

13、ase P中的蛋白组分没有催化功能，只是起稳定构象的作用。1969年，日本千佃一郎首次在工业规模上用固定化氨基酰化酶固定在DEAE-葡萄糖凝胶上从DL-氨基酸生产L-氨基酸。 第二章 微生物发酵产酶一、 名词解释诱导物：能够引起诱导作用的物质。诱导作用：加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行的现象。终产物阻遏：催化某一特异产物合成的酶，在培养基中有该产物存在的情况下常常是不合成的，即受阻遏的。这种由于终产物的过量积累而导致的生物合成途径中酶合成的阻遏称为终产物阻遏。分解代谢产物阻遏：指某些物质（主要是指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现

14、象。葡萄糖效应：在有葡萄糖存在的情况下，优先利用葡萄糖生长，待葡萄糖耗尽后，再利用另一种底物生长。 组成型酶：在细胞中的量比较恒定，环境因素对其合成速率影响不大的一类酶。适应型酶：在细胞中的含量变化很大，合成速率明显受环境因素影响的一类酶。 结构基因：是决定合成某一种蛋白质或RNA分子结构相应的一段DNA。把携带的遗传信息转录给mRNA,再以mRNA为模板合成具有特定氨基酸序列的蛋白质或RNA。启动子：DNA分子上能被RNA聚合酶识别、结合并形成转录起始复合体的区域。 操纵子：由启动基因、操纵基因和结构基因一起组成的一个转录功能单位。操纵基因：位于结构基因的一端，是操纵结构基因的基因。调节基因

15、：是调节蛋白质合成的基因。它能使结构基因在需要某种酶时就合成某种酶,不需要时,则停止合成，它对染色体上的结构基因有调节作用。 固定化细胞：是指固定在水不溶性载体上，在一定的空间范围进行生命活动（生长、繁殖和新陈代谢等）的细胞。原生质体：脱去细胞壁的细胞叫原生质体。CAP：指分解代谢物活化蛋白。在分解代谢阻遏中调节基因的产物是降解物基因活化蛋白（CAP），它能与 环腺苷酸（cAMP）结合而被活化，帮助RNA聚合酶与启动子结合，促进转录进行。胞内酶：在细胞内起催化作用的酶，这些酶在细胞内常与颗粒体结合并有着一定的分布。胞外酶：细胞内合成而在细胞外起作用的酶，包括位于细胞外表面或细胞外空间的酶。二、

16、填空 1. 微生物细胞中对酶的生物合成最重要的调节是转录水平的调节，主要调节方式有分解代谢物阻遏作用、酶合成的诱导作用、酶合成的反馈阻遏作用。2. 根据细胞生长与酶生物合成的关系，酶生物合成的模式可分为同步合成型、延续合成型、中期合成型、滞后合成型 。其中 同步合成型和延续合成型的酶合成可以受诱导物的诱导，而中期合成型和滞后合成型的酶合成受阻遏，同步合成型和中期合成型的酶所对应的mRNA 稳定性较差；而延续合成型和滞后合成型的酶所对应的mRNA 稳定性好。3. 产酶微生物具有酶的产量高、容易培养和管理、产酶稳定性好、利于酶的分离纯化、安全可靠，无毒性特点。4. 细胞生长的莫诺德动力学模型为 =

17、dX/dt1/X=mS/Ks+S ，其中Ks代表 莫诺德常数 ，是指 比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。m为 最大比生长速率，是指 限制性底物浓度过量时的比生长速率。5. 酶发酵生产的前提之一，是根据产酶的需要，选育得到性能优良的微生物。一般说来，优良的产酶微生物应当具备的条件酶的产量高、容易培养和管理、产酶稳定性好、利于酶的分离纯化、安全可靠，无毒性.6. 根据细胞生长与酶产生的关系可把酶生物合成的模式分4种类型：同步合成型、延续合成型、中期合成型、滞后合成型，其中理想模式应是延续合成型。三、判断 1. 同步合成型的酶的生物合成与细胞生长是同步进行的。 2. 延续合成型的酶

18、的生物合成在细胞生长到达平衡期后开始。错（延续合成型的酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，进入平衡期后还可以延续合成一段较长时间。） 3. 滞后合成型的酶的生物合成是在细胞生长一段时间或进入平衡期以后才大量开始。 4. 中期合成型的酶的生物合成是在细胞生长进入平衡期以后才开始。错（中期合成型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，平衡期以后停止。） 5. 同步合成型的酶所对应的mRNA很稳定。错（同步合成型的酶所对应的mRNA很不稳定。） 6. 色氨酸操纵子对酶生物合成的调节属于反馈阻遏作用。四、简答1.举例说明酶生物合成调节作用机制在产酶微生物菌种改造中的指导意义。答：酶生物合成的反馈阻遏作用：例如

19、色氨酸操纵子的调节机制。在没有阻遏物存在时，调节基因(R)产生的阻遏蛋白与操纵基因(O)的亲和力弱，不能与操纵基因结合，所以RNA聚合酶可以结合到其在启动基因的结合位点上，进行转录，而合成结构基因（S）所对应的酶。 当环境中色氨酸浓度增加，阻遏物达到一定浓度时，阻遏蛋白与阻遏物结合，使其结构发生改变，从而使阻遏蛋白与操纵基因的结合能力增强。阻遏蛋白与操纵基因结合，就排挤RNA聚合酶与启动基因的结合，使转录无法进行，酶的生物合成因此受到阻遏。2举例说明酶生物合成调节作用机制在酶发酵过程优化中的指导意义。答：（1）：酶生物合成调节的方式：诱导和阻遏。（2）：诱导：诱导酶是由诱导物诱导产生的。所以可

20、以多加些诱导物来诱导酶的合成。但是在实践中，为了能够大量生产各种诱导酶，需要用突变作用来消除微生物酶的合成须依赖外来的诱导物这种天生的障碍。例如：在诱导物为限制性机制的恒化器中筛选大肠杆菌在低乳糖浓度的恒化器中生长，就可以筛选出能在无诱导物存在的条件下形成半乳糖苷酶。（3）：阻遏：末端产物阻遏：代谢途径中末端代谢产物过量积累而引起的阻遏。例如：谷氨酸棒杆菌在生产谷氨酸时会因为谷氨酸的过量积累而抑制谷氨酸的产生，所以可以增加菌的细胞膜透性是合成的谷氨酸迅速分泌到胞外。：分解代谢物阻遏：葡萄糖效应 例如：大肠杆菌会在葡萄糖用尽的情况下才启动利用乳糖的相关的酶的合成，所以在培养基中不应该添加葡萄糖，

21、只添加乳糖。3. 简要回答酶的催化特点。答：（1）酶催化的高效性；（2）酶催化的高度专一性；(3) 酶催化的反应条件温和；（4）酶活性的可调控性；（5）结合酶催化的活性与辅酶、辅基和金属离子有关。4 简要回答对微生物产酶菌种的要求？答：（1）酶的产量高 （2）容易培养和管理 （3）产酶稳定性好 （4）利于酶的分离纯化 （5）安全可靠，无毒性5.如果要筛选酸性蛋白酶高产菌株，请制定筛选计划。答:筛选计划如下：（1）采样 从肉类加工厂附近和饭店排污水污泥中分离得到蛋白酶的产生菌（2）富集培养 改变培养基的PH值到2.04.0进行培养使目的菌相对数量加速增加（3）分离培养 在产生菌的分离平板中加入适

22、量的奶粉能产生蛋白酶的菌株就可以因为蛋白酶分解奶粉的蛋白质使其周围形成透明圈而被分离出来（4）目的微生物的筛选 挑取单菌落涂布镜检形态特征,挑选高纯度的菌株穿刺低温保藏 6.结合酶生物合成模式，浅谈如何提高酶的生物合成量?答：酶的生物合成模式有4种，同步合成型，延续合成型，中期合成型，滞后合成型。 同步合成型的酶可以由其诱导物诱导生成，可在进入旺盛生长期时，添加适宜诱导物，可以显著提高酶产量。还要尽量提高其对应的mRNA的稳定性，为此适当降低发酵温度也是可采取的措施。 延续合成型的酶受诱导物诱导，不受分解代谢物阻遏，可以在细胞生长平衡期，加入适宜诱导物。 中期合成型的酶受到产物的反馈抑制作用或

23、分解代谢物阻遏，通过控制阻遏物的浓度，可以提高酶产量。为了减少或解除代谢物阻遏的酶，应当降低培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度，可以采用其他较难利用地碳源如淀粉，控制碳源的浓度在较低水平。对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。 滞后合成型的酶要设法降低培养基中阻遏物的浓度，尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢阻遏作用，是酶的生物合成提早开始。 另外，添加表面活性剂和产酶促进剂也可提高某些酶的产量。7. 黑曲霉可由果胶诱导合成聚半乳糖醛酸酶，葡萄糖的大量存在阻遏聚半乳糖醛酸酶的合成。当以纯果胶为诱导物时，该酶的生物合成模式为哪种类型？若以含有葡萄糖的粗果胶为

24、诱导物时，该酶又成为哪种合成模式？为什么？答：当以纯果胶为诱导物时，培养一段时间以后（约40小时），细胞生长进入旺盛时期，此时，聚半乳糖醛酸酶开始合成；当细胞生长达到平衡期（约80小时）后，细胞生长达到平衡，然而该酶却继续合成，直至120小时以后，呈现延续合成型的生物合成模式。若以含有葡萄糖的粗果胶为诱导物时，细胞浓度在20小时达到高峰，但是聚半乳糖醛酸酶的生物合成由于受到分解代谢物阻遏作用而推迟合成的时间，直到葡萄糖被细胞利用完之后，酶才开始合成，呈现出滞后合成型的合成模式。8、 根据你所学的知识，阐述酶合成的理论基础以及酶的发展前景。答：酶合成的理论基础：转录和翻译。构建有别于天然功能酶的

25、新酶类，例如：催化抗体（Catalyticantibody）并称抗体酶（Abzyme）是人们赋予其催化功能的免疫球蛋白，抗体是目前最大的多样性家族，与抗原有结合部位与酶相似，但无催化活性。酶促催化在于与底物结合产生过渡态，降低能障。人工合成酶（Synzyme）是合成具有催化功能的高聚物分子，目前使用分子印迹和生物印迹技术制备人工酶，原理与抗体酶过渡态理论大致相同，已经初步制备了具有蛋白酶功能，氧化还原酶催化功能的人工酶，人工酶亦可用于手性药物及化合物的分离纯化及生物传感器的分子识别，目前人工酶的催化转换数仍很低，需要多学科配合，对酶催化分子机理的深入了解，才会有可能在特殊反应中优于天然酶。9、

26、比较细胞生长与酶产生的关系可将酶生物合成分为几种类型模式，简述其特点。说明在酶的发酵生产中最理想的合成模式。答：（1）酶生物合成的模式可根据细胞生长与酶产生的关系分为4种类型：同步合成型(生长偶联型)、延续合成型、中期合成型、滞后合成型（非生长偶联型）。（2）其中理想模式应是延续合成型。延续合成型的酶其生物合成可受诱导物的诱导，一般不受分解代谢物阻遏；该类酶在细胞生长达到平衡期以后，仍然可以延续合成，酶所对应的mRNA相对稳定。10、酶发酵生产的前提之一，是根据产酶的需要，选育得到性能优良的微生物。说明优良的产酶微生物应当具备的条件。答：优良的产酶微生物应当具备的条件酶的产量高；稳定性好；易培

27、养；利于分离纯化；安全无毒。11、简述转录与翻译过程。 答：（一）转录包括4个步骤：(1)转录的起始：全酶的形成酶与模版结合酶与启动基因结合模版DNA局部变性转录开始(2)RNA链的延伸:全酶释放因子，成为核心酶，核心酶沿DNA模版移动生成多聚核苷酸链，再逐渐形成双螺旋。(3)RNA链的终止：当RNA转录酶转录到终止子时，合成终止。(4)RNA前体的加工：包括一系列的催化反应，这些酶反应主要包括剪切反应，剪接反应，末端连接反应，核苷酸修饰反应等。 （二）翻译包括5个步骤：（1）氨基酸活化生成氨酰-tRNA:氨基酸在氨酰-tRNA合成酶的催化作用下，由ATP提供能量，与特定的tRNA结合生成氨酰

28、tRNA.（2）肽链合成的起始：在GTP和起始因子的参与下，核糖体30S亚基，fMET-tRNA,mRNA和50S亚基结合，组成起始复合物。（3）肽链的延伸： 启始复合物形成后，fmet-tRNA便结合到P位，tRNA反密码子与mRNA上的密码子AUG识别配对。 在延伸因子EF1、EF2等的作用下，第二个AA-tRNA与mRNA第二个密码子配对，并处在A位点。 在肽基转移酶的作用下，P位的甲硫氨酸的羧基与A位上第二个氨基酸的氨基形成肽键，附着在A位的tRNA上。 P位上的tRNA离开核糖体，核糖体沿着mRNA的3端移动，结果是A位上的tRNA移动到空出来的P位。 mRNA第三个密码子暴露A位，

29、让第三个AA-tRNA进入。不断重复这一过程，直到终止密码出现，多肽链的合成便告结束。（4）肽链合成的终止：释放因子进入核糖体A位，合成的肽链被释放出来。核糖体解离。（5）蛋白质前体的加工：主要包括N端甲酰甲硫氨酸或甲硫氨酸的切除，二硫键的形成，肽链的剪切，氨基酸侧链修饰，肽链的折叠和亚基的聚合等。12、用操纵子模型解释酶的诱导与阻遏机制（末端产物、分解代谢产物）答案：（1）酶的诱导：当无诱导物存在时，调节基因产生的阻遏物与操纵基因结合，阻止了RNA聚合酶的转录，因而结构基因不能表达。当有诱导物存在时，由于诱导剂与阻遏蛋白结合，从而改变了阻遏蛋白的构型，使之不能与操纵基因结合，则RNA聚合酶可

30、以进行转录，结构基因得以表达。（2）反馈阻遏：当无阻遏物时存在时，调节基因产生的阻遏蛋白不能与操纵基因结合，因此，RNA聚合酶可以与启动基因结合，从而使结构基因表达合成对应的酶；当阻遏物达到一定浓度时，阻遏蛋白与阻遏物结合，使其结构发生改变，从而使阻遏蛋白与操纵基因结合，使转录无法进行，酶的合成受到阻遏。（3）分解代谢物阻遏：由于某些物质经过分解代谢放出能量，有一部分储存在ATP中，ATP是由AMP和ADP通过磷酸化生成的。因此，细胞中ATP浓度增加时，AMP浓度降低。存在于细胞中的cAMP水解生成AMP。同时，腺苷酸环化酶的活化受到抑制而使cAMP的生成受阻，从而导致细胞内cAMP浓度降低，

31、则cAMPCRP的复合物的浓度就随之降低，使得启动基因上没有足够的cAMPCRP的复合物结合，RNA聚合酶也无法结合到启动基因的相应位点上，转录无法进行，酶的生物合成受到阻遏。反之，ATP浓度降低，细胞内ADP、AMP、cAMP的浓度增加 ，cAMPCRP的复合物结合到启动基因的特定位点上，RNA聚合酶也结合到启动基因的相应位点上，酶的生物合成进行。13、优良产酶微生物菌种的获得途径及各自特点。答：现大多数的酶都采用微生物细胞发酵生产，产酶微生物包括细菌、放线菌、霉菌、酵母等。优良产酶菌种应从富含该酶作用底物的场所采集样品,也可从菌种保藏机构有关研究部门获得。第三章 动植物细胞培养产酶一、名词

32、解释：1、操纵子：在原核生物中，很多功能上相关的基因排列成串，由一个共同的控制区转录，包括结构基因、控制区以及调节基因的整个核苷酸序列叫做操纵子。操纵基因:是操纵子上位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。2、诱导酶：在正常细胞中没有或只有很少量存在，但当环境中有诱导物（一般是反应的底物）存在时，微生物细胞会因诱导物存在而产生的酶就是诱导酶，诱导酶的合成除取决于环境中诱导物外，还受基因控制。组成酶是微生物细胞内一直存在的酶，它的合成仅受遗传物质控制。3、胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、 纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利

33、用环境中的大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，胞内也能维持较低水平，受到的调节控制少。胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶，酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调控。4、外植体：从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块。愈伤组织：将外植体植入诱导培养基中，于25左右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团。5、初筛：是指选育产酶菌种时对菌种的第一次分离筛选，以获得一定数目的菌种为主要目的。复筛：是指选育产酶菌种时对菌种的第二次分离筛选，选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。6、端粒：真核生物线性染色体的末端结构，为一特

34、定的DNA-蛋白质复合体结构。其DNA序列由对生物特异的简单的串联重复单位组成，能抵消每一轮DNA复制中因染色体降解而造成的关键功能码序列的丢失。端粒酶：一种自身携带模板的逆转录酶，由RNA和蛋白质组成，RNA组分中含有一段短的模板序列与端粒DNA的重复序列互补，而其蛋白质组分具有逆转录酶活性，以RNA为模板催化端粒DNA的合成，将其加到端粒的3端，以维持端粒长度及功能。7、抗体酶：又称催化性抗体，是一类具有生物催化功能的抗体分子。8、SOD：超氧化物歧化酶，能够催化O2-和氢离子反应形成过氧化氢和分子氧的酶，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，具有抗衰老的活性。二、简答：1、答：三者

35、的不同点见下表：微生物植物动物细胞结构有细胞壁，细胞体积小有细胞壁，细胞体积大无细胞壁，细胞体积较大培养基培养基成分简单，需要6大营养要素，常用的培养基有牛肉膏蛋白胨培养基等。培养基成分相对动物细胞简单，在培养基中需要加入大量无机盐，还需要加生长激素、维生素等。使用的氮源为无机氮源。常用的培养基有MS,B5,N6培养基培养基成分复杂，培养基中需要加入各种必需氨基酸，生长因子，激素等。使用的培养基含血清的培养基或人工合成培养基。培养方式微生物细胞的大规模培养主用使用悬浮培养。植物细胞的大规模培养主要也是悬浮培养，但由于植物细胞对剪切力较敏感，因此培养时通风和搅拌不应强烈。并且植物细胞培养要求一定

36、的光照。大多数动物细胞由于锚地依赖性，所以不适宜悬浮培养。但近年来由于多孔载体的出现，使得动物细胞也可以在液体培养基中培养，适合大规模生产。2、答：酶合成的模式主要有以下四种：（1）同步合成型。同步合成型是酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式，又称生长偶联型。属于这一类型的酶，其生物合成伴随细胞的生长而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量合成；当细胞生长进入平衡期时，酶的合成随着停止。（2）延续合成型。延续合成型是酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后酶还可以延续合成一段较长时间的一种酶生物合成模式。（3）中期合成型。中期合成型酶在细胞生长一段时间以后才开始，而

37、在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。（4）滞后合成型。滞后合成型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累，又称为非生长偶联型。在四种模式中，延续合成型酶的合成可受诱导而又一般不受分解代谢物和产物阻遏，其所对应的mRNA相当稳定，是生产中最理想的合成模式。3、答：动植物细胞中酶生物合成的调节主要有以下四种：（1）细胞分化改变酶的生物合成，这主要与基因表达的时间和空间特异性造成的。（2）基因扩增加速酶的生物合成。通过基因扩增来调节酶的生物合成可以在某些特殊条件下发生，作为应急手段使某种酶的合成大量增加。（3）增强子促进酶的生物合成。增强子是一段能高效增强或促

38、进基因转录的DNA序列，在酶的生物合成过程中，可以高效增强某些酶基因的表达。（4）抗原诱导抗体酶的生物合成。4、答：端粒酶是一种自身携带模板的逆转录酶，由RNA和蛋白质组成，RNA组分中含有一段短的模板序列与端粒DNA的重复序列互补，而其蛋白质组分具有逆转录酶活性，以RNA为模板催化端粒DNA的合成，将其加到端粒的3端，以维持端粒长度及功能。其催化过程为：（1）结合：端粒酶分子的RNA重复序列与DNA端粒末端按照互补原则结合。（2）延伸：以端粒酶分子的RNA为模板，通过反转录作用，使DNA分子上的端粒延伸。（3）移位：端粒酶移动到延伸后的端粒末端。重复上述过程，反复进行，使端粒不断延伸。5、答

39、：抗体酶的合成主要是由抗原诱导合成的，包括半抗原诱导法和酶蛋白诱导法。（1）半抗原诱导法。这种方法是以预先设计的过渡态类似物作为半抗原，与载体蛋白偶联制成抗原，然后免疫动物，再经过单克隆抗体制备技术制备、分离、筛选得到所需的抗体酶。（2）酶蛋白诱导法。酶蛋白诱导法是以某种酶蛋白作为抗原诱导抗体酶产生的方法。首先选定一种酶蛋白作为抗原免疫动物，在酶蛋白抗原的诱导下，动物体内产生与酶分子特异结合的抗体，再将获得的酶抗体来免疫该动物，并采用单克隆抗体制备技术得到与酶抗体特异结合的抗抗体。那么，抗抗体结合部位的构象与用作抗原的酶分子的结合中心的构象相同。对抗抗体进行筛选，就有可能获得具有催化活性的抗体

40、酶。6、答：植物细胞培养产酶具有以下几个特点：（1）提高产率。使用高产、稳定的植物细胞进行培养，可明显提高天然产物产率。（2）缩短周期。植物细胞生长的倍增时间一般为12-60 h，发酵周期15-30天，与完整植物的生长周期比较，大大缩短了生产周期。（3）易于管理，减轻劳动强度。培养在人工控制条件的生物反应器中进行，不受地理环境和气候条件的影响，易于操作管理。（4）提高产品质量。植物细胞培养主要产物的产率较高，杂质少，易于分离。（5）与微生物细胞相比，植物细胞在培养过程中具有对剪切力敏感的缺点。7、答：以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例，具体步骤如下：（1）大蒜愈伤组织的诱导 选取结

41、实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后无菌水漂洗3次。 在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的半固体MS培养基中，在25，600lux，12h/d光照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次。（2）大蒜悬浮细胞培养 将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA（苄基腺嘌呤） 的液体MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25，600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d，使愈伤组织分散成为小细

42、胞团或单细胞。 然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25,600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d。（3）酶的分离纯化 细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。8、答：以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原活化剂为例，具体步骤为：（1）人黑色素瘤细胞培养1）将人黑色素瘤的种质细胞用胰蛋白酶消化处理，细胞分散后，用pH7.4的磷酸缓冲液洗涤，计数，稀释成细胞悬浮液。2）在消毒好的反应器中装进一定量的培养液，将上述细胞悬浮液接种至反应器中，接种浓度为（13）103个细胞/mL，

43、于37的CO2培养箱中，通入含5%CO2的无菌空气，培养至长成单层致密细胞。3）倾去培养液，用pH7.4的磷酸缓冲液洗涤细胞23次。4）换入一定量的无血清Eagle培养液，继续培养。5）每隔34 d，取出培养液进行tPA的分离纯化。6）再向反应器中加入新鲜的无血清的Eagle培养液（最低必需培养液）继续培养，以获得大量的tPA。（2）组织纤溶酶原活化剂的分离纯化在获得的上述培养液中加入一定量的蛋白酶抑制剂和表面活性剂，过滤去沉淀，适当稀释后，采用亲和层析技术进行分离（以tPA抗体为配基，以溴化氢活化的琼脂糖凝胶电泳为母体制成亲和层析剂，上柱、洗涤后用3mol/LKSCN溶液洗脱，分部收集），得

44、到tPA溶液。经过浓缩、葡聚糖G-150凝胶层析、冷冻干燥，得到精制的tPA干粉。 第四章 酶的提取与分离1、 名词解释ATPE：Aqueous two phase system双水相萃取技术，是利用聚合物-盐或聚合物-聚合物混合系统所出现的两相不相混溶的水相进行萃取的操作技术。IEC：离子交换层析，是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。HPLC：高压液相层析，采用高压输液系统，利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的方法。2DE：双向凝胶电泳，根据蛋白质的等电点和分子量大小，分别在

45、凝胶介质二维空间上对蛋白质分子进行等电点聚焦和SDS-PAGE来分离与纯化蛋白质的方法。 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。电渗：在电场中，溶液对于固体支持物的相对移动为电渗。层析：是利用混合液中各组分的物理化学性质（分子额大小和形状、分子的极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等)的不同，使各组分以不同比例分布在固定相和流动相两相中的技术。2、细胞破碎的方法有哪些？原理是什么？ 答：有四种 （1)、机械破碎法，包括捣碎法、研磨法、匀浆法。原理：通过机械运动产生的剪切力，使组织细胞破碎。 （2）、物理破碎法，包括温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法。原理：

46、通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。 （3）、化学破碎法，包括添加有机溶剂和添加表面活性剂。原理：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，从而使细胞破碎。 （4）、酶促破碎法，包括自溶法和外加酶制剂法。原理：通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破环，从而达到细胞破碎。3、 简述酶的提取方法及影响酶提取的主要因素。 答：主要有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶液提取。 主要影响因素：温度、PH、提取液的体积。4、 简述差速离心和密度梯度离心分离酶的原理及各自特点。 答：差速离心原理：采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离

47、特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒，操作简单、方便。但是分离 效果较差， 不能一次得到纯颗粒，壁效应严重，并使沉降的颗粒受到挤压。 密度梯度离心原理：样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的组分 得以分离，当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在 密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到 与它们各自的密度恰好相等的位置，形成一系列密度区，从而 使不同浮力密度的物质得到分离。 特点：（1）区带内的液相介质密度小于样品物质颗粒的密度。 （2）适宜分离密度相近而大小不同的固相物质。5、 简述双水相萃取和反胶束萃取、超临界流体萃取的原理及各自特点。 答：双水相萃取原理：

48、利用不同溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同的原理而达 到分离。 特点：1）每一水相中均有很高的含水量，为酶等生物物质提供了一个良 好的环境；2）高分子聚合物的水溶液对酶等无毒害作用，不会引 起变性。3）分离后酶浓度低，需经过浓缩等以提高浓度。4）双水 相系统中含有高分子聚合物或盐类，分离后需进一步进行分离 化，以除去分子聚合物或盐类等杂质。 反胶束萃取原理：将表面活性剂溶于非极性溶剂，使其浓度超过临界胶束浓度，形成 反胶束，利用反胶束将酶或其他蛋白质从混合液中萃取出来。 特点：1）萃取率和反萃取率高。2）分离浓缩同时进行，溶剂可反复利用。 3）解决胞内酶在非细胞环境中迅速失活问题。4）破壁

49、功能，直接 从完整细胞提取酶蛋白。5）成本低。 超临界流体萃取原理：利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离， 溶解度大的物质溶解在超临界流体中，与不溶解或溶解度小的物质 分开，然后通过升高温度或降低压力，使超临界流体变为气态而得 到所需物质。 特点：(1)萃取速度高与液体萃取，特别适合于固态物质的分离提取；(2) 在接近常温的条件下操作，适合于热敏性物质和易氧化物质的分离； (3)传热速率快温度易于控制；(4)适合于挥发性物质的分离；5）超 临界流体萃取萃取速度快，对物质的萃取具有选择性，萃取后易分 离。6、 如何理解灌注色谱是生物大分子分离纯化的一个重大突破，并以酶为例加以

50、说明。 答：灌注色谱法就是采用大孔填料，在高流速下产生溶质随流动相穿透填料粒子的传质方式的新型色谱技术。这种介质一个突出特点是孔内“停滞流动相的传质阻力”大大减小。这是因为颗粒内的传质过程主要靠穿透孔内的对流传递，生物大分子溶质能随流动相的液流迅速达到孔内的活性表面。降低了溶质在介质内停留的限制，明显的缩短了蛋白质的分离时间。无论是分析色谱还是制备色谱，进行时得到的蛋白质质量、产量、产率都有所提高。在高流速下也不会因为传质太慢而使谱带展宽。能以比HPLC快10-100倍的速度在较短时间内进行生物大分子的分离，同时分离度和柱容量损失小，特别适用于生物大分子的快速分析和规模制备。 例如用POROS

51、R/M填料能在较短时间内完成含有核糖核酸酶、卵清蛋白等蛋白质混合物的快速分离。7. 简述结晶与沉淀的区别，酶结晶的基本原理及影响结晶的主要因素。答：沉淀为初分离过程，结晶一般为分离的后续步骤，属于成品化过程。1）区别：形态的不同，同类分子或离子以有规则排列形式而析出称结晶，同类分子或离子以无规则的紊乱排列形式而析出称沉淀。酶结晶原理：酶液浓度处于稍微过饱和状态下会发生结晶（酶浓度过低无法析出结晶，过高会形成许多小晶核，结晶小不易长大）。2）影响因素：(1)纯度：纯度越高越易结晶（ 50）纯度是指所需要的组分在样品总量中所占的比例(一船为质量分数)。杂质占比例越低，则所制备物质的纯度越高。各种物

52、质在溶液中均需达到一定的纯度才能析出结晶，这样就可使结晶和母液分开，以达到进一步分离纯化的目的。生化产品也不例外，一般说来纯度愈高愈易结晶。就蛋白质和酶而言，结晶所需纯度不低于50，总的趋势是越纯越易结晶。结晶的制品并不表示达到了绝对的纯化，只能说达到了相当纯的程度。但有时纯度虽不高，若加入有机溶剂和制成盐时，也能得到结晶。(2)浓度：浓度越高越易结晶，控制在饱和区以上，过饱和区以下的介稳区内。结晶液一定要有合适的浓度，溶液中的溶质分子或离子间便有足够的相碰机会，并按一定速率作定向排列聚合才能形成晶体。但浓度太高达到饱和状态时，溶质分子在溶液中聚集析出的速度太快，超过这些分子形成晶体的速率，相

53、应溶液粘度增大，共沉物增加，反而不利于结晶析出，只获得一些无定形固体微粒，或生成纯度较差的粉末状结晶。结晶液浓度太低，样品溶液处于不饱和状态，结晶形成的速率远低于晶体溶解的速率，也得不到结晶。因此只有在稍过饱和状态下，即形成结晶速率稍大于结晶溶解速率的情况下才能获得晶体。结晶的大小、均匀度和结晶的饱和度有很大关系。(3)pH值pH值的变化可以改变溶质分子的带电性质，是影响溶质分子溶解度的一个重要因素。在一般情况下，结晶液所选用的pH 值与沉淀大致相同。蛋白质、酶等生物大分子结晶的pH 值多选在该分子的等电点附近。如溶菌酶的等电点为11.011.2，5溶菌酶溶液，pH 值9.510，在4放置过夜

54、便析出结晶。如果结晶时间较长并希望得到较大的结晶时，pH 值可选择离等电点远一些，但必须保证这些分子的生物活性不受损害。(4)温度冷却的速度及冷却的温度直接影响结晶效果冷却太快引起溶液突然过饱和，易形成大量结晶微粒，甚至形成无定形沉淀。冷却的温度太低，溶液浓度增加，也会干扰分子定向排列，不利于结晶的形成。生物大分子整个分离纯化过程，包括结晶在内，通常要求在低温或不太高的温度下进行。低温不仅溶解度低，而且不易变性，并可避免细菌繁殖。在中性盐溶液中结晶时，温度可在0至室温的范围内选择。(5)时间结晶的形成和生长需要一定时问，不同的化合物，结晶时间长短不同。蛋白质、酶等生物大分子结晶时，由于分子内有

55、许多功能基团和活性部位，其结晶的形成过程也复杂得多。简单的无机或有机分子形成晶核时需要几十甚至几百个离子或分子组成。但蛋白质分子形成晶核时，只需很少几个分子即可，不过这几个分子整齐排列成晶核时比几十个、几百个分子、离子所费时间多得多，所以蛋白质、核酸等生物大分子形成结晶常需要较长时间，因此经常需要放置。在生化产品制备中，时间不宜太长，通常要求在几小时之内完成，以缩短生产周期，提高生产效率。(6)晶种不易结晶的生化产品常需加晶种。有时用玻璃棒摩擦容器壁也能促进晶体折出。8. 试论述如何利用本章所学的各种分析技术对特定的蛋白酶进行酶学性质（如分子质量、pI、带电状态、亚基组成、溶解性等）研究。答：1、荧光探针技术不但可以对原来不发荧光的物质进行极微量的测定，而且利用它的特异性结合对环境的敏感， 可为生物大分子结构和功能的研究，提供很多有用的信息。1）、蛋白质疏