菌落总数与大肠菌群数测定

菌落总数与大肠菌群数测定第一页，共三十九页，编辑于2023年，星期二主要内容菌落总数测定大肠菌群测定MPN法原理（拓展内容）第二页，共三十九页，编辑于2023年，星期二菌落总数测定掌握菌落总数测定方法实验原理 不同稀释度的样品，营养琼脂培养基，36℃，48h（水产品30℃，72h），菌落数第三页，共三十九页，编辑于2023年，星期二菌落总数测定器材与试剂：样品，无菌生理盐水，平板计数琼脂培养基，1ml吸管，培养皿第四页，共三十九页，编辑于2023年，星期二菌落总数测定第五页，共三十九页，编辑于2023年，星期二倾注培养第六页，共三十九页，编辑于2023年，星期二培养结果第七页，共三十九页，编辑于2023年，星期二菌落总数测定实验步骤

5.菌落计数：肉眼观察，可用放大镜，可标记必要时分区计数，菌落成片者作废计算方法某稀释度的菌落数：两平板菌落数取平均值选择菌落数在30-300之间的稀释度（1）仅有一个稀释度在此范围：菌落数×稀释倍数第八页，共三十九页，编辑于2023年，星期二菌落总数测定计算方法：（2）有两个稀释度在30-300之间菌落数之比>2，选较小值菌落数之比<2，取平均值（3）所有稀释度均>300

取稀释倍数最大者（4）所有稀释度均<30

取稀释倍数最小者（5）没有任何稀释度在30-300之间选最接近该范围者结果单位：CFU/ml（g）第九页，共三十九页，编辑于2023年，星期二菌落总数测定注意事项：

1.无菌操作

2.标记

3.何时更换吸管

4.吸吹混匀

5.琼脂培养基保温

6.安全常识第十页，共三十九页，编辑于2023年，星期二大肠菌群数测定实验目的实验原理

36℃，48h，产气（小倒管）三步法：初发酵、复发酵器材与试剂样品、无菌生理盐水、LST肉汤，BGLB肉汤

1ml吸管、10ml吸管、试管、小倒管第十一页，共三十九页，编辑于2023年，星期二初发酵器材与试剂样品、225ml无菌生理盐水、9ml无菌生理盐水、双料LST肉汤，单料LST肉汤，10ml吸管、1ml吸管、吸球第十二页，共三十九页，编辑于2023年，星期二大肠菌群数测定实验步骤：

1.初发酵

第十三页，共三十九页，编辑于2023年，星期二第十四页，共三十九页，编辑于2023年，星期二第十五页，共三十九页，编辑于2023年，星期二吸取样品方法第十六页，共三十九页，编辑于2023年，星期二加注样品第十七页，共三十九页，编辑于2023年，星期二初发酵结果右边为阳性结果，小倒管内有气体产生。第十八页，共三十九页，编辑于2023年，星期二实验步骤

3.复发酵（1）选取产气试管（2）接种至10mlBGLB肉汤中（3）培养：36℃，48h

（4）观察指标：若产气则报告大肠菌群阳性。第十九页，共三十九页，编辑于2023年，星期二大肠菌群数测定实验步骤

2.分离培养（1）制备伊红美蓝平板：

45℃，无菌，倾注，15ml

（2）选产酸产气的发酵管（3）接种至伊红美蓝平板分区划线法（4）培养：36℃，48h第二十页，共三十九页，编辑于2023年，星期二分离培养器材与试剂初发酵结果（4只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰平板培养基第二十一页，共三十九页，编辑于2023年，星期二分区划线法第一区划线灭菌接种环第二区划线灭菌接种环第三区划线灭菌接种环第二十二页，共三十九页，编辑于2023年，星期二分区划线法操作要点

1.划下一个区前必须灭菌接种环

2.划线时接种环同平板呈30-40°角

3.每次划线应该压到上一个区域的2-3条线

4.用接种环的“面”而不是“弧”在平板上滑动第二十三页，共三十九页，编辑于2023年，星期二大肠菌群数测定实验步骤

2.分离培养：

（5）菌落特征：深紫黑色、有金属光泽紫黑色、无或略有金属光泽淡紫红色、中心颜色深（6）革兰染色、镜检：选特征菌落第二十四页，共三十九页，编辑于2023年，星期二革兰染色法器材与试剂结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、酸性复红、生理盐水、酒精灯、载玻片、滤纸第二十五页，共三十九页，编辑于2023年，星期二革兰染色法涂片：接种环，挑取菌落，生理盐水一滴，涂匀热固定：通过火焰若干次初染：结晶紫一滴，1min，水洗媒染：卢戈碘液一滴，1min，水洗脱色：95%乙醇，30s或至无色为止复染：复红一滴，30s第二十六页，共三十九页，编辑于2023年，星期二涂片第二十七页，共三十九页，编辑于2023年，星期二热固定第二十八页，共三十九页，编辑于2023年，星期二初染第二十九页，共三十九页，编辑于2023年，星期二媒染第三十页，共三十九页，编辑于2023年，星期二脱色第三十一页，共三十九页，编辑于2023年，星期二复染第三十二页，共三十九页，编辑于2023年，星期二革兰氏染色阴性革兰氏染色阳性革兰染色法第三十三页，共三十九页，编辑于2023年，星期二复发酵器材与试剂培养24小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接种环、复发酵管第三十四页，共三十九页，编辑于2023年，星期二大肠菌群数测定实验步骤

3.复发酵（1）选取鉴定为无芽孢G-杆菌的菌落1-3个（2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液（3）培养：37℃，24h

（4）观察指标：产酸，产气第三十五页，共三十九页，编辑于2023年，星期二液体接种第三十六页，共三十九页，编辑于2023年，星期二复发酵复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产生第三十七页，共三十九页，编辑于2023年，星期二大肠菌群数测定注意事项：

1.无菌操作

2.吸管使用

3.洗去染液的方法

4.显微镜保养

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