细胞培养教学

细胞培养教学第一页，共六十四页，编辑于2023年，星期一本章学习项目内容利用生物反应器进行细胞因子的大规模生产——尿激酶原，EPO利用原代和传代细胞生产狂犬疫苗利用CHO细胞生产乙肝疫苗利用杂交瘤技术制备单克隆细胞株利用单克隆细胞株生产生物制品细胞培养在组织工程中的应用第二页，共六十四页，编辑于2023年，星期一项目教学生物反应器培养昆虫细胞制备尿激酶原THEPREPARATIONOFPRO-UKININSECT

CELLCULTRUREINBIOREACTORS第三页，共六十四页，编辑于2023年，星期一使用美国N.B.S公司的篮式生物反应器和Disk聚酯纤维片状载体，对Sf9昆虫细胞大规模高密度贴壁培养工艺以及昆虫细胞-杆状病毒AcMNPV表达尿激酶原(pro-UK)工艺进行初步研究

摘要第四页，共六十四页，编辑于2023年，星期一摘要昆虫细胞的贴壁适应含小牛血清的TNM-FH培养液对片状载体进行预处理降低搅拌速度、提高接种密度、采用罐流培养以及禁止CO2气体的使用，使昆虫细胞的培养密度能够达到5.0×106/ml以上。第五页，共六十四页，编辑于2023年，星期一在Sf9细胞培养了3天至5天达到较高密度时，接种一定量的AcMNPV，感染指数一般为4左右，并在病毒感染后，采用罐流收获的方式，根据pro-UK的表达量，及时调整罐流速度，使收液保持在600～1200IU/ml相对较高的酶活性。摘要第六页，共六十四页，编辑于2023年，星期一通过生物反应器的收液与玻璃瓶的培养收液的电泳图谱比较，反应出生物反应器收液的pro-UK表达量明显高于瓶中培养收液，纤维蛋白琼脂糖平板的测活也充分地证明了这一点。摘要第七页，共六十四页，编辑于2023年，星期一关键词：生物反应器，昆虫细胞，杆状病毒，尿激酶原Keywords:bioreactor,insectcells,baculovirus,pro-UK第八页，共六十四页，编辑于2023年，星期一第一部分引言

1.1尿激酶原概述1.2昆虫细胞-杆状病毒表达系统及其应用1.3生物反应器细胞培养中的应用1.4本研究的设计思路、意义和目的第九页，共六十四页，编辑于2023年，星期一实验材料与方法……………………...41.材料与仪器………………………...41.1材料…………….41.2主要仪器设备…………………...41.3主要试剂………………………...42.实验方法………….62.1载体的处理……………………..62.2生物反应器培养前的准备…………………….62.3生物反应器昆虫细胞培养时各种参数的调节……………….72.4细胞培养方法…………………..72.5病毒感染及收获…………………82.6检测方法……………

第十页，共六十四页，编辑于2023年，星期一实验设计、结果和分析………………131.感染前各因素的改变对昆虫细胞培养影响实验…………

….131.1载体的处理处理方法对昆虫细胞贴壁影响的实验…………131.2搅拌速度对昆虫细胞贴壁于载体影响的实验………………141.3昆虫细胞批式培养和灌注培养的比较实验…………………141.4接种浓度对细胞生长的影响实验……………151.5CO2对细胞生长影响的研究……………………161.6培养过程中细胞浓度与葡萄糖代谢的关系第十一页，共六十四页，编辑于2023年，星期一实验设计、结果和分析………………131.感染前各因素的改变对昆虫细胞培养影响实验……………….131.1载体的处理处理方法对昆虫细胞贴壁影响的实验…………131.2搅拌速度对昆虫细胞贴壁于载体影响的实验………………141.3昆虫细胞批式培养和灌注培养的比较实验…………………141.4接种浓度对细胞生长的影响实验……………151.5CO2对细胞生长影响的研究……………………161.6培养过程中细胞浓度与葡萄糖代谢的关系第十二页，共六十四页，编辑于2023年，星期一第二部分生物反应器昆虫细胞的培养2.2实验仪器与材料2.2.1实验仪器：篮式生物反应器：2.5L和5L的，其中2.5L反应器内装0.8L篮筐，能容纳80g载体，工作容积1.6L；5L反应器内装1.7L篮筐，能容纳160g载体，工作容积3.5L，美国NBS生产，见图1第十三页，共六十四页，编辑于2023年，星期一图1.生物反应器及灌流培养示意

图2.片状载体照片

Fig1.PictureofbioreactorcultureFig2.Pictureofdiskcarrier

第十四页，共六十四页，编辑于2023年，星期一超净工作台：蚌埠净化设备厂生产。二氧化碳培养箱：美国热电公司生产。倒置显微镜：型号CKX41，日本OLYMPUS公司生产。分光光度计：型号UV-2201,日本岛津公司生产。2.2.2实验用载体：Disk片状载体（见图2）：主要由聚酯纤维构成，圆片状，直径为5.5mm，表面固着一层聚丙烯网，美国N.B.S公司提供。2.2.3实验试剂：2.2.3.1细胞培养基：Grace’s培养基、酵母粉、乳白蛋白，均为GIBCO产品。2.2.3.2新生牛血清：购自杭州四季青生物材料有限公司。2.2.3.3葡萄糖检测试剂盒：购自南京建成生物工程研究所。第十五页，共六十四页，编辑于2023年，星期一2.2.3.4.1无钙、镁的磷酸盐缓冲液（PBS）：

Na2HPO412H2O25.98gNaH2PO42H2O4.36gNaCl8.78g将上述盐类依次溶于900ml蒸馏水中，定容至1000ml。2.2.3.4.2TNM-FH培养液：Grace’s培养基粉460g酵母粉33g乳白蛋白33gNaHCO33.5g第十六页，共六十四页，编辑于2023年，星期一将上述粉末依次溶于9500ml蒸馏水中，平衡2小时，用5N的NaOH溶液调节PH至6.1，并定容至10000ml，除菌过滤后，2～8℃保存备用。2.2.3.4.3细胞生长液：含有8%～10%小牛血清的TNM-FH培养液。2.2.3.4.4细胞维持液：含有1%～3%小牛血清的TNM-FH培养液。2.2.4实验用的细胞株：Sf9细胞株：一种昆虫细胞，从草地夜蛾IPLB-Sf21-AE细胞克隆分离出来的第9号细胞株（Spodopterafrugiperda9，Sf9），购于ATCC。第十七页，共六十四页，编辑于2023年，星期一2.3实验操作2.3.1载体的处理[9]新载体直接用于培养细胞，而用过的载体再用时，先用清水洗涤3次，然后用0.1N醋酸浸泡4～6小时，再用清水洗涤3～5次，烘干灭菌后备用。2.3.2生物反应器培养前的准备2.3.2.1罐体处理用清水洗涤几次后用0.1N的NaOH溶液浸泡4～6小时，再用清水洗涤2次后用0.1N醋酸浸泡过夜，倒出酸液，用清水洗涤后备用。第十八页，共六十四页，编辑于2023年，星期一2.3.2.1空罐灭菌将载体装入罐内的篮筐中，加量为170-190克/5L反应器，盖好罐盖，用纸包好所有罐盖上的开口以及管道的开口，放到高压灭菌柜中灭菌（121℃，45分钟）。2.3.2.2实罐灭菌将新配好的PBS加入到灭好菌的罐体中，加量为2/3罐体容积，安装上溶氧电极以及校对好的pH电极，关闭与罐内液体接触的管道，放到高压灭菌柜中灭菌（121℃，45分钟）。第十九页，共六十四页，编辑于2023年，星期一2.3.3电极和蠕动泵的校准2.3.3.1pH电极的校对检查pH电极没有损伤后，用电缆与生物反应器的主机连接，将显示屏打倒pH的窗口，用pH为4.003的标准液校对“0”点；即在屏幕上不管显示是不是4.003，只要稳定了，即可在设定栏处设定为4.00。同样方法，用pH为6.86的标准液校对“span”点。第二十页，共六十四页，编辑于2023年，星期一2.3.3.2溶氧电极的校对实罐灭菌后校对溶氧电极，即将主机打开，显示屏打到溶氧窗口，断开电极与主机，此时窗口显示的值设定为“0”点；用电缆连接电极与主机，开动反应器搅拌，使之达最大转速，通空气的情况下搅拌10～20分钟，显示屏上的数值基本稳定不再上升，将此值设定为“100”点。第二十一页，共六十四页，编辑于2023年，星期一2.3.3.2蠕动泵流量校正蠕动泵的液体流速与硅胶管道的直径大小有关。校正蠕动泵流量时把硅胶管道连接在蠕动泵上，启动校正程序，一定时间后终止校正程序，并输入量筒中流入的蒸馏水的体积数，控制器自动计算蠕动泵的流速并储存结果，校正完成。第二十二页，共六十四页，编辑于2023年，星期一2.3.4生物反应器昆虫细胞培养时各种参数的调节2.3.4.1搅拌速度培养初期使用35～45rpm，培养后视培养液的溶氧值（DO值）情况适当调节搅拌速度，最大转速可达80rpm。2.3.4.2温度细胞增殖培养时控制温度设定为26.5℃～27.5℃，维持培养时，温度调节为25.5℃～26.5℃。第二十三页，共六十四页，编辑于2023年，星期一2.3.4.3pH值细胞增殖培养时控制pH设定为6.0～6.2，维持培养时，控制pH设定为6.2～6.4。2.3.4.4DO值培养初期,使用压缩空气维持DO值，并将DO设定为30%～50%；培养中后期，一般在4～5天，当细胞迅速生长时，使用氧气和氮气调节溶氧值，并将DO设定为60%～80%。2.3.4.5灌流量每天取样测定反应器内的细胞密度、葡萄糖浓度，以之为参考调整液体的灌流量。第二十四页，共六十四页，编辑于2023年，星期一2.3.5细胞培养方法2.3.5.1细胞复苏(1)从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入盛有37℃水中，轻轻摇动冻存管，尽快解冻；(2)解冻后，用75%酒精擦试消毒冻存管，在超净工作台上开盖，用吸管吸出细胞悬液轻轻加入已装有5ml生长液的25cm2一次性细胞培养瓶中（生长液事先4℃预冷），室温放置30分钟后，置27℃培养箱培养；(3)27℃培养箱培养2～3小时后，细胞基本贴于瓶下面，轻轻吸出上清液，加入8ml的新鲜生长液，再置27℃培养箱中继续培养。第二十五页，共六十四页，编辑于2023年，星期一2.3.5.2细胞传代取生长良好的Sf9细胞，轻轻吸出大部分上清液，补加适当的生长液，轻轻吹散贴在瓶壁上的细胞制成均匀细胞悬液，按1：2或1：3移入灭菌的细胞瓶，每瓶补加适量生长液，置27℃恒温培养。第二十六页，共六十四页，编辑于2023年，星期一2.3.5.3细胞接种于反应器及培养一般6～7个生长良好摇瓶中的Sf9细胞（100～120ml的细胞悬液/瓶），收集到灭菌后的接种瓶中，并将收集瓶与反应器用灭菌的管道进行连接，用蠕动泵缓地将细胞悬液泵入反应器中，一般细胞接种密度为1.0×105～5.0×105/ml。设定培养条件，即转速：35～80rpm，温度：27℃，pH：6.2，DO：50%，进行生物反应器的细胞培养，一般培养12小时后开始灌流培养。第二十七页，共六十四页，编辑于2023年，星期一2.3.6细胞取样通过反应器上的取样器抽取载体，消化上面的细胞并计数，计算每片载体上的细胞，再核算出反应器中的细胞浓度；取培养液，用试剂盒测定培养液的葡萄糖含量。第二十八页，共六十四页，编辑于2023年，星期一2.4结果与讨论

2.4.1载体的处理方法对昆虫细胞贴壁的影响A为载体未用培养基浸泡；B为载体用培养基浸泡24小时；C为载体用含10%牛血清的培养基浸泡

接种的细胞浓度均在1.40～1.55×105/ml，并分别在接种后的第1、第2、第3、第4、第5、第6小时取反应器中的培养液第二十九页，共六十四页，编辑于2023年，星期一第三十页，共六十四页，编辑于2023年，星期一

从表1的结果可以看出：载体经含血清的培养基浸泡后，载体对细胞的吸附力增强，含10%血清的培养基浸泡了2到24小时，细胞的贴壁率效果基本相同，说明载体经10%血清的培养基浸泡了2小时后接种细胞，细胞在5小时后，5%细胞已贴壁于载体。第三十一页，共六十四页，编辑于2023年，星期一2.4.2搅拌速度对昆虫细胞贴壁于载体的影响A组：30rpmB组：50rpmC组：100rpmD组：150rpm利用2.5L篮式生物反应器，将细胞的接种浓度控制在1.40～1.50×105/ml，并分别在4次的接种细胞后，设定搅拌速度为30rpm、50rpm、100rpm、150rpm，分别在接种后的30、60、120、180、240以及300分钟的时候取培养液，计数此时的细胞浓度。第三十二页，共六十四页，编辑于2023年，星期一第三十三页，共六十四页，编辑于2023年，星期一从表2不难看出，昆虫细胞在生物反应器的初期，搅拌速度对细胞的贴壁有一定的影响，搅拌速度越大，越不利于细胞贴壁于载体。当搅拌速度达到150rpm时，接种后300分钟，细胞几乎没有贴壁于载体。第三十四页，共六十四页，编辑于2023年，星期一2.4.3昆虫细胞批式培养和灌流培养的比较细胞的批次培养是指细胞接种后，收获之前，培养液不进行换液，最后一次性收获系统制备的产物罐流培养是指在细胞培养过程中，不断地更换培养液，使培养环境处于一个动态的健康的培养状态。为了比较和验证两种培养方式对昆虫细胞生长的不同影响，特此进行以下试验

第三十五页，共六十四页，编辑于2023年，星期一两次的细胞接种浓度均为1.0×105cells/ml。批次培养5天不更换培养液；灌流培养是在接种后12小时开始灌流，灌流速度为0.2V/day，48小时后改变灌流速度为0.5V/day，一直到120小时（5天）。每天取载体进行消化计数细胞，算出此时的细胞浓度，从而比较相同的培养时间不同的培养方式的昆虫细胞生长状况，见图3

批次培养方式和灌流培养方式第三十六页，共六十四页，编辑于2023年，星期一第三十七页，共六十四页，编辑于2023年，星期一批次培养过程中的第4天，细胞密度缓慢地达到最大值1.54×106/ml。灌流培养过程中，由于培养液的营养成分不断地更新，细胞很快进入了对数生长期。在培养的第4天，细胞密度达到最大值5.06×106/ml，是批次培养细胞密度最高值的3.3倍。此时灌流速度为0.5V/day，如果灌流培养的第4天继续增大灌流速度，细胞密度有可能还会继续提高。第三十八页，共六十四页，编辑于2023年，星期一2.4.4接种浓度对细胞生长的影响本实验利用灌流培养，分别采用接种浓度为0.5×105cells/ml、1.0×105cells/ml、5.0×105cells/ml，3次培养均在接种后12小时开始灌流培养，灌流速度为0.2V/day，48小时后改变灌流速度为0.5V/day，一直到120小时（5天）并且每天取载体进行消化计数细胞，算出此时的细胞浓度，比较不同的细胞接种密度，在培养过程中的相同培养时间点上昆虫细胞生长的状况，见图4。第三十九页，共六十四页，编辑于2023年，星期一第四十页，共六十四页，编辑于2023年，星期一在图4中，可以很清楚地看出，细胞接种量越低，细胞生长的延迟期越长，细胞很长时间才能达到密度最高；细胞接种越大，细胞就会在短时间内达到最高密度，但由于培养过程中培养液营养成分的限制，细胞达到最大密度后，细胞密度会很快降低；根据培养情况，及时加大灌流培速度，使营养成分的更新速度加快，从而使细胞密度会大大地增大。第四十一页，共六十四页，编辑于2023年，星期一2.4.5CO2对细胞生长的影响动物细胞的生物反应器培养时，一般均采用空气、氧气、氮气和CO2等四种气体为培养系统维持罐内压和供氧，甚至协同地起到调节培养酸碱度的作用第四十二页，共六十四页，编辑于2023年，星期一利用两次篮式生物反应器的批次培养，一次批次培养的接种浓度为1.0×105cells/ml；采用3种气体（空气、氧气和氮气）来维持培养过程中罐内的压力和供氧；另一次批次培养的接种浓度为1.2×105cells/ml，采用4种气体（空气、氧气、氮气和二氧化碳）来维持培养过程罐内的压力和供氧第四十三页，共六十四页，编辑于2023年，星期一第四十四页，共六十四页，编辑于2023年，星期一没有使用CO2气体的批次培养中细胞密度则可以达到1.54×106/ml，而使用了CO2气体的批次培养过程中，自接种到第5天。细胞密度基本没变，甚至有下降的趋势。说明CO2气体对昆虫细胞具有一定的毒性，不利于昆虫细胞的生长第四十五页，共六十四页，编辑于2023年，星期一2.4.6培养过程中细胞浓度与葡萄糖代谢的关系本实验分别采用批次培养和灌流培养的方式培养昆虫细胞，并连续取样监测和观察5天。其中批次培养5天一直不更换培养液；灌流培养则从接种后12小时开始灌流，灌流速度为0.2V/day，48小时后改变灌流速度为0.5V/day，一直到120小时。每天取样测定细胞浓度和葡萄糖浓度，并绘制成曲线图，见图6、图7。第四十六页，共六十四页，编辑于2023年，星期一第四十七页，共六十四页，编辑于2023年，星期一第四十八页，共六十四页，编辑于2023年，星期一第四十九页，共六十四页，编辑于2023年，星期一从上面两图中，可以发现细胞在对数生长期的时候，培养液中的葡萄糖浓度急剧下降。而在图6中的细胞对数生长率（曲线的陡度）远不如图7中的细胞对数生长率，但葡萄糖浓度的下降程度却远大于图7中的下降程度从两图的曲线中可以看出，灌流培养的细胞最大浓度远远高于批次培养的细胞最大浓度。在灌流培养过程的后期，葡萄糖也能维持较高的浓度，一般在100～200ug/ml。所以灌流培养有助于昆虫细胞的高密度培养。结果分析讨论第五十页，共六十四页，编辑于2023年，星期一第三部分昆虫细胞-杆状病毒系统对尿激酶原的表达3.4结果与讨论3.4.1接毒时间对pro-UK表达的影响A：细胞培养了3天感染病毒B：细胞培养了4天感染病毒C：细胞培养了5天感染病毒第五十一页，共六十四页，编辑于2023年，星期一结果分析讨论这三种培养，均在细胞培养阶段，细胞的接种浓度均为1.0×105cells/ml，均采用相同方式的灌流培养，培养条件保持一致。病毒的接毒时的感染指数（MOI）均为4，感染后分别每天取样进行pro-UK生物活性的测定，将测定的结果用EXCEL文件绘制成曲线图，从而观察接毒时间对系统pro-UK表达的影响。第五十二页，共六十四页，编辑于2023年，星期一第五十三页，共六十四页，编辑于2023年，星期一实验结果（见图8）可以看出，在昆虫细胞接种后的3天到5天期间接种AcMNPV病毒，其对感染后的表达pro-UK基本没有影响，仅仅是A，也就是3天接毒的，到表达最高峰下降的较快。在灌流培养过程，细胞在3天到5天期间已经达到了细胞对数生长期的后期，为细胞密度最大值的前后，细胞密度不会相差很大

第五十四页，共六十四页，编辑于2023年，星期一3.4.3批次收获与灌流收获过程中pro-UK表达的比较实验设计是根据收液方式的不同将实验分成两组：批次收获组和灌流收获组。两组的均在细胞培养了96小时，接种AcMNPV病毒，且MOI均为4。批次收液方式为5天为一次换液单位，灌流收液方式为感染后24小时开始进行灌流收液，收液速度为0.5V/day。两组收液的过程中每天从反应器中取样进行pro-UK生物活性的测定，将测定的结果用EXCEL文件绘制成曲线图，从而反应出系统的pro-UK表达情况。第五十五页，共六十四页，编辑于2023年，星期一第五十六页，共六十四页，编辑于2023年，星期一

本实验结果如图10。批次收获方式由于培养液在一定的时间内不更换，细胞得不到充足的营养，系统的表达水平明显较低，最高的表达时间为感染后的第4天，pro-UK的生物活性为631IU/ml。而灌流收获方式，由于细胞是在一个动态平衡的培养系统中，营养丰富，有害物质及时被排走，所以系统的表达水平相对较高，最高的表达活性出现在感染后的第5天，活性为1021IU/ml，并在很长时间内维持在600IU/ml以上（见图11）。因此灌流收获方式有利于系统pro-UK的表达。第五十七页，共六十四页，编辑于2023年，星期一第五十八页，共六十四页，编辑于2023年，星期一3.4.4灌流收获过程中细胞密度、灌流量与pro-UK表达的关系利用篮式生物反应器进行灌流培养昆虫细胞，当细胞密度到一定密度后（一般超过5.0×106cells/ml）