第三章细胞生物学的研究方法

第一节细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜二、电子显微镜三、扫描隧道显微镜当前第1页\共有66页\编于星期五\21点一、光学显微镜技术☆基本构造：光学放大系统、照明系统、机械和支架系统当前第2页\共有66页\编于星期五\21点普通光学显微镜成像原理物镜得到物体放大的实像;目镜把物镜成的像进一步放大。当前第3页\共有66页\编于星期五\21点显微镜和显微技术几个基本概念：放大分辨率反差能辨别两点之间最小距离的能力与显微镜的自身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术，这就是显微技术。被观察物区别于背景的程度被观察物越小，放大倍数应越大，否则难以看清！当前第4页\共有66页\编于星期五\21点决定光学显微镜的分辨率的要素

D＝0.61λ∕［N·sin(α/2)］D:分辨率λ：入射光的波长N：介质的折射率（1或1.5）α：物镜的镜口角当前第5页\共有66页\编于星期五\21点当前第6页\共有66页\编于星期五\21点（一）普通复式光学显微镜分辨率指区分开两个质点间的最小距离。两个质点之间的距离取决于光源波长λ，物镜镜口角a和介质折射率ND=0.61λ/N×sin(a/2)空气（N=1.0）、水（N=1.33）、香柏油（N=1.52）当前第7页\共有66页\编于星期五\21点显微镜的种类及原理普通光学显微镜光学显微镜一般配置的最大放大倍数是多少？为什么？如何实现光学显微镜一般配置的最大放大倍数？其原理？目镜：10~15×；物镜：100×；总放大倍数1000~1500×；使用油镜，即在100×物镜和载玻片之间滴加香柏油；当前第8页\共有66页\编于星期五\21点普通光学显微镜分辨率与所用波长成反比！当前第9页\共有66页\编于星期五\21点用浸没油取代空气的作用?介质折射率提高分辨率得到提高改变光折射角度增加照明亮度很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。浸没油与玻璃的折射率相近当前第10页\共有66页\编于星期五\21点Makingtissuesections.Howanembeddedtissueissectionedwithamicrotomeinpreparationforexaminationinthelightmicroscope.普通光镜的观察取材－固定－脱水－包埋－切片－脱蜡－复水－染色－脱水－透明－封片－观察步骤：当前第11页\共有66页\编于星期五\21点观察结果当前第12页\共有66页\编于星期五\21点（二）荧光显微镜技术是光镜水平对特异蛋白质等生物大分子定性定位的最有力的工具。主要是用于检测细胞上的特异荧光材料；与普通光学显微镜不同的是增加了两套滤光片。

第一套称为激发光滤片，装在光源和样品之间，只有那些能激发荧光材料发光的特定波长的光才能通过。第二套称为阻断滤片，装在物镜和目镜之间，只让燃料所发出的荧光通过。在黑暗背景的衬托下，发出荧光的样品很容易被观察。当前第13页\共有66页\编于星期五\21点Theopticalsystemofamodernfluorescencemicroscope.Afiltersetconsistsoftwobarrierfilters(1and3)andadichroic(beam-splitting)mirror(2).Inthisexamplethefiltersetfordetectionofthefluorescentmoleculefluoresceinisshown.荧光显微镜的光路图当前第14页\共有66页\编于星期五\21点Fluorescentdyes.Thestructuresoffluoresceinandtetramethylrhodamine,twodyesthatarecommonlyusedforfluorescencemicroscopy.Fluoresceinemitsgreenlight,whereastherhodaminedyeemitsredlight.荧光染料分子当前第15页\共有66页\编于星期五\21点荧光显微镜的应用B：不同荧光素所需激发波长与所产生的荧光波长比较C：细胞有丝分裂中期的观察。当前第16页\共有66页\编于星期五\21点荧光显微镜观察真菌的细胞核MDFA/4d/DAPIstain(400×)WT∆cdc15CM由于荧光显微镜的暗视野为荧光信号提供了强反差背景，非常微弱的荧光信号亦可得以分辨。当前第17页\共有66页\编于星期五\21点（三）激光共焦点扫描显微镜特点：排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.4-1.7)，可重构样品的三维结构,主要用来研究细胞亚结构。激光共聚焦扫描显微镜（Confocallaserscanningmicroscope，CLSM）：

用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。当前第18页\共有66页\编于星期五\21点激光扫描共焦显微镜的原理图原理：激光束经双色镜反射后，通过物镜聚集到样品某一焦点；从焦点发射的荧光经透镜汇聚成像，被检测出；其他部位发射的荧光不聚焦成像，不能检测到。当前第19页\共有66页\编于星期五\21点荧光显微镜（A）和激光扫描共焦显微镜（B）所观察图像的比较小鼠肾小球的厚切片当前第20页\共有66页\编于星期五\21点Figure3-14.Comparisonofconventionalandconfocalfluorescencemicroscopy.Thesetwomicrographsareofthesameintactgastrula-stageDrosophilaembryothathasbeenstainedwithafluorescentprobeforactinfilaments.Theconventional,unprocessedimage(A)isblurredbythepresenceoffluorescentstructuresaboveandbelowtheplaneoffocus.Intheconfocalimage(B),thisout-of-focusinformationisremoved,whichresultsinacrispopticalsectionofthecellintheembryo.

当前第21页\共有66页\编于星期五\21点相差显微镜（phase-contrastmicroscope）

一种将相位差转变成振幅差（明暗差）的显微镜，可观察不染色的活细胞。利用样品的不同位点的密度差，形成肉眼可见的明暗区别。微分干涉显微镜（differential-interferencemicroscope）

一种将样品厚度上的微小区别转化成明暗区别相差显微镜。录像增差显微镜技术（video-enhancemicroscopy）（四）其它光学显微镜当前第22页\共有66页\编于星期五\21点相差显微镜观察真菌菌丝2dWT∆cdc15CM3d当前第23页\共有66页\编于星期五\21点两种不同类型的光学显微镜所拍摄的图像比较体外培养的MDCK细胞的图像A:普通显微镜所拍B：相差显微镜所拍当前第24页\共有66页\编于星期五\21点二、电子显微镜（一）、电子显微镜的基本知识1.电子显微镜与光学显微镜的基本区别2.电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数3.电子显微镜的基本构造（二）、主要电镜制样技术1.超薄切片技术2.负染色技术3.冷冻蚀刻技术4.电镜三维重构与低温电镜技术5.扫描电镜技术当前第25页\共有66页\编于星期五\21点二、电子显微镜技术当前第26页\共有66页\编于星期五\21点电子显微镜的基本结构（A）和成像原理（B）当前第27页\共有66页\编于星期五\21点电子显微镜与光学显微镜的区别

显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可见光（400-700）紫外光（约200nm)电子束（0.01-0.9）玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差主要区别（1）光源不同光镜为可见光或紫外线；电镜为电子束（2）透镜不同光镜为玻璃；电镜为电磁透镜（3）真空系统（4）显示记录系统当前第28页\共有66页\编于星期五\21点超薄切片技术固定、脱水、包埋、切片、染色。基本要求：细胞精细结构保存良好，不产生明显的物质凝聚、丢失或添加人工效应等；切片厚度在500埃左右，最大不超过1000埃（1mm厚的样品切成20000片；一个一般大小的细胞要切成300片）切片应耐受电子束的轰击，包埋介质不发生变形；切片应具有良好的反差；切片需均匀，没有皱褶、刀痕及染色剂沉淀等缺陷。当前第29页\共有66页\编于星期五\21点SpecimenPreparationforElectronMicroscopyThinSectioningforTEMThewaxsections:3-10um;ThePlasticultrathin-sectionsforTEM:40-50nmSectionsofLM:>5um;SectionsofTEM:<100nm

当前第30页\共有66页\编于星期五\21点电镜超薄切片样本制备示意图当前第31页\共有66页\编于星期五\21点Figure3-20.Electronmicrographofaroot-tipcellstainedwithosmiumandotherheavymetalions.Thecellwall,nucleus,vacuoles,mitochondria,endoplasmicreticulum,Golgiapparatus,andribosomesareeasilyseen.当前第32页\共有66页\编于星期五\21点超薄切片技术显示的动物细胞超微结构当前第33页\共有66页\编于星期五\21点家蚕细小病毒负染色电镜照片（病毒直径20nm）当前第34页\共有66页\编于星期五\21点II.Scanningelectronmicroscope(SEM)

ImagesofsurfacescanbeobtainedbySEM;Critical-pointdrying;Range:15－150,000X.Resolution:5nm当前第35页\共有66页\编于星期五\21点Figure3-23.Scanningelectronmicroscopy.Scanningelectronmicrographofthestereociliaprojectingfromahaircellintheinnerearofabullfrog(A).Forcomparison,thesamestructureisshownbydifferential-interference-contrastlightmicroscopy(B)andbythin-sectionelectronmicroscopy(C).当前第36页\共有66页\编于星期五\21点

Figure3-32.Cellsinculture.Scanningelectronmicrographofratfibroblastsgrowingontheplasticsurfaceofatissue-culturedish.当前第37页\共有66页\编于星期五\21点扫描电镜原理示意图（A），扫描电镜下可清晰地显示原生动物四膜虫表面的纤毛和口器（B）当前第38页\共有66页\编于星期五\21点三、隧道扫描显微镜原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。特点：（1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。（侧分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.01nm）； （2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息；（3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量； （4）可连续成像，进行动态观察。用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。当前第39页\共有66页\编于星期五\21点几种显微镜可观察的样品大小（箭头之间的范围）及其分辨能力（右侧箭头所指位置）分辨率：能区分开两个质点间的最小距离眼睛、光学显微镜和电子显微镜的分辨率分别为：0.2mm、0.2μm和0.2nm。当前第40页\共有66页\编于星期五\21点第二节细胞及其组分的分析方法一、用超离心技术分离细胞组分二、细胞成分的细胞化学显示方法三、特异蛋白抗原的定位与定性四、细胞内特异核酸的定位与定性五、定量细胞化学分析与细胞分选技术当前第41页\共有66页\编于星期五\21点一、用超离心技术分离细胞组分用差速离心法分离细胞匀浆中的各种细胞组分当前第42页\共有66页\编于星期五\21点用密度梯度离心分离细胞组分示意图用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。当前第43页\共有66页\编于星期五\21点二、细胞成分的细胞化学显示方法为了测定蛋白质、核酸、多糖和脂质等细胞组分，通常利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合（反应）的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和相对含量。当前第44页\共有66页\编于星期五\21点A:直接免疫荧光标记技术：利用偶联荧光分子的抗体与细胞或细胞切片进行孵育，使抗体和相应抗原结合，在荧光显微镜下对抗原进行定位的技术。B:间接免疫荧光标记技术：即不带荧光标记的第一抗体与相应抗原孵育形成复合物后，再用荧光标记的第二抗体识别第一抗体，从而显示抗原所在位置。

三、特异蛋白抗原的定位与定性当前第45页\共有66页\编于星期五\21点免疫胶体金电镜原位杂交技术的基本原理与应用（膀胱上皮细胞膜蛋白的分布：箭头所指）当前第46页\共有66页\编于星期五\21点四、细胞内特异核酸的定位与定性原位杂交（insituhybridization）：通过单链RNA或DNA探针对细胞或组织中的基因或mRNA进行定位的技术。

当前第47页\共有66页\编于星期五\21点用原位杂交技术显示Z13基因在受精后1d的斑马鱼胚胎的体节、眼和松果体中的表达（箭头所指）当前第48页\共有66页\编于星期五\21点五、定量细胞化学分析与细胞分选技术流式细胞术：一种用于核酸、蛋白质、染色体和细胞等的定量、分离和分选的技术。当前第49页\共有66页\编于星期五\21点流式细胞仪的工作原理当前第50页\共有66页\编于星期五\21点第三节细胞培养与细胞工程一、细胞培养二、细胞工程当前第51页\共有66页\编于星期五\21点一、细胞培养

原代培养：用直接从生物体获得的细胞所进行的培养的过程。

传代培养：对原代培养的细胞进行分割，重新接种进行再培养的过程。细胞系：来源于动物或植物细胞，能够在体外培养过程中连续增殖的细胞群体。当前第52页\共有66页\编于星期五\21点动物细胞培养A：正在生长分裂的HeLe（宫颈瘤）细胞B:长满单层的CHO（中国仓鼠卵巢）原代细胞当前第53页\共有66页\编于星期五\21点植物细胞培养单倍体细胞培养原生质体培养

当前第54页\共有66页\编于星期五\21点二、细胞工程细胞融合：两个细胞通过质膜的接触并相互融合形成一个细胞的过程。融合后的细胞只有一个连续的细胞质膜。单克隆抗体：单个细胞克隆所合成针对一种抗原决定簇的抗体。杂交瘤技术：由一个正常的产生抗体的B淋巴细胞与一个恶性骨髓瘤细胞融合产生的杂种细胞系。具有无限增殖和产生单克隆抗体的特性。细胞拆合：即先把细胞核与细胞质分离开来，然后把不同来源的核体和胞质体相互融合，形成核-质杂交细胞。当前第55页\共有66页\编于星期五\21点单克隆抗体制备过程体外培养当前第56页\共有66页\编于星期五\21点应用显微注射技术进行细