第7章蛋白质分离纯化

蛋白质的分离纯化与表征蛋白质的酸碱性质蛋白质分子的大小与形状蛋白质胶体与沉淀蛋白质分离纯化的一般原则蛋白质分离纯化的方法蛋白质含量测定与纯度鉴定第七章蛋白质的分离纯化与表征当前第1页\共有65页\编于星期五\21点蛋白质的酸碱性质蛋白质中可解离的基团蛋白质的等电点1－蛋白质的酸碱性质当前第2页\共有65页\编于星期五\21点蛋白质中可解离的基团-NH3+pKa=7.6~8.4-COO-pKa=3~3.2NextPage1－蛋白质的酸碱性质当前第3页\共有65页\编于星期五\21点蛋白质中可解离的基团-COO-pKa=3.0~4.7-COO-pKa=4.41－蛋白质的酸碱性质当前第4页\共有65页\编于星期五\21点蛋白质中可解离的基团pKa=5.6~7.0-NH2pKa=9.4~10.61－蛋白质的酸碱性质当前第5页\共有65页\编于星期五\21点蛋白质中可解离的基团pKa=11.6~12.6pKa=9.8~10.4pKa=9.1~10.81－蛋白质的酸碱性质当前第6页\共有65页\编于星期五\21点蛋白质的等电点蛋白质等电点蛋白质等电点胃蛋白酶1.0-胰凝乳蛋白酶8.3卵清蛋白4.6-胰凝乳蛋白酶原9.1血清清蛋白4.7核糖核酸酶9.5-乳球蛋白5.2细胞色素C10.7胰岛素5.3溶菌酶11.0血红蛋白6.71－蛋白质的酸碱性质当前第7页\共有65页\编于星期五\21点蛋白质分子的大小与形状根据化学组成测相对分子量渗透压法测相对分子量扩散系数法测相对分子量沉降分析法测相对分子量凝胶过滤法测相对分子量SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测相对分子量2－蛋白质的分子形状与大小当前第8页\共有65页\编于星期五\21点根据化学组成测相对分子量肌红蛋白（Mb）M.W.=(Fe原子量)/(Mb中Fe含量)*100=55.8/0.335*100=16700血红蛋白（Hb）一分子中含有4个Fe原子，因此：MW=4*16700=668002－蛋白质的分子形状与大小当前第9页\共有65页\编于星期五\21点渗透压法测相对分子量=RT(+K*c2)cMrc=RTMr+K*cc~cMr=RTlimc0cMr=10000~1000002－蛋白质的分子形状与大小当前第10页\共有65页\编于星期五\21点扩散系数法测相对分子量Fick第一扩散定律：扩散系数D求法（Fick第二扩散定律）dmdt=-D*A*dcdxdcdt=-Dd2cdx2c2c1=exp(-)x22-x124Dt2－蛋白质的分子形状与大小当前第11页\共有65页\编于星期五\21点扩散系数法测相对分子量扩散系数D随蛋白质Mr的增加而降低。蛋白质Mr扩散系数（107cm2s-1)核糖核酸酶A1260011.9细胞色素c1337011.4肌红蛋白1690011.3凝乳蛋白酶原232409.5血红蛋白645006.9过氧化氢酶2475004.1肌球蛋白5248001.12－蛋白质的分子形状与大小当前第12页\共有65页\编于星期五\21点沉降分析法测相对分子量蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力作用时，如果蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会沉降。沉降速率与蛋白质分子的大小和密度有关，而且与分子形状、溶液的密度和粘度有关。2－蛋白质的分子形状与大小当前第13页\共有65页\编于星期五\21点沉降分析法测相对分子量斯维得贝格方程：Mr=RTsD(1-)s为沉降系数:单位秒-1，通常将10-13秒作为一个单位用S表示为偏微比容：蛋白质溶于水为0.74cm3/g为溶剂的密度2－蛋白质的分子形状与大小当前第14页\共有65页\编于星期五\21点2－蛋白质的分子形状与大小当前第15页\共有65页\编于星期五\21点凝胶过滤法测相对分子量洗脱液体积（mL）蛋白质含量相对分子量MrABCD待测蛋白分子量2－蛋白质的分子形状与大小当前第16页\共有65页\编于星期五\21点SDS-聚丙烯酰胺

凝胶电泳法测相对分子量电泳时的迁移率取决于蛋白的净电荷、分子大小、形状；SDS（十二烷基硫酸钠）与蛋白质结合，使全部呈负电荷，同时改变蛋白质单体分子构象成近似球形；巯基乙醇打开二硫键，使亚基分离；电泳时蛋白质向正极移动。分连续和不连续体系（圆盘电泳）2－蛋白质的分子形状与大小当前第17页\共有65页\编于星期五\21点SDS-聚丙烯酰胺

凝胶电泳法测相对分子量2－蛋白质的分子形状与大小当前第18页\共有65页\编于星期五\21点SDS-聚丙烯酰胺

凝胶电泳法测相对分子量ABRf=A/B2－蛋白质的分子形状与大小当前第19页\共有65页\编于星期五\21点蛋白质胶体性质胶体稳定性的三个要素：质点大小1~100nm；带相同电荷；形成溶剂化层；稳定亲水性蛋白质胶体的因素：水化层：双电层：3－蛋白质的胶体性质当前第20页\共有65页\编于星期五\21点蛋白质的沉淀盐析法：NaCl、(NH4)2SO4有机溶剂沉淀：乙醇、丙酮重金属盐沉淀：Hg2+、Ag+生物碱与某些酸类沉淀：单宁酸、TCA加热变性沉淀：3－蛋白质的胶体性质当前第21页\共有65页\编于星期五\21点蛋白质分离纯化的一般原则总目标：增加蛋白质含量与生物活性，除去不必要的杂质蛋白；前处理：细胞破碎粗分级分离：盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等细分级分离：层析、电泳、结晶4－蛋白质的分离纯化当前第22页\共有65页\编于星期五\21点蛋白质的分离纯化方法根据下列性质将蛋白分离纯化： 分子大小 溶解度 电荷 吸附性质 对配体分子的亲和力4－蛋白质的分离纯化当前第23页\共有65页\编于星期五\21点透析与超过滤4－蛋白质的分离纯化当前第24页\共有65页\编于星期五\21点透析通常是将浓缩液装在一个用赛咯吩（cellophane）制造的透析袋内，两端都密封好，然后将透析袋悬浮在一个装有很多缓冲液的容器内进行透析。因为赛咯吩膜是半通透的膜，蛋白质等大分子不能透过膜，仍然留在袋内，但蛋白质周围的小分子可以与缓冲液进行交换，通过多次更换透析液，就可除去小分子（如硫酸铵）。经硫酸铵分级纯化、透析的粗分级的蛋白质样品可以通过以下一些常用的分离纯化技术和方法进一步纯化和鉴定。4－蛋白质的分离纯化当前第25页\共有65页\编于星期五\21点当前第26页\共有65页\编于星期五\21点超滤超滤是一种膜分离技术，它的特点是使用不对称多孔膜，根据分子的大小来分离溶液中的大分子物质与小分子物质。超滤尤其适用于大分子溶液的浓缩，不同种类分子的纯化以及溶剂交换等。超滤法是一种温和的、非变性的物理分离方法。4－蛋白质的分离纯化当前第27页\共有65页\编于星期五\21点超滤离心管切向流超滤器4－蛋白质的分离纯化当前第28页\共有65页\编于星期五\21点离心技术离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。密度梯度离心技术是利用每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的密度梯度时即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自的区带。常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度等。4－蛋白质的分离纯化当前第29页\共有65页\编于星期五\21点差

速

离

心Differentialcentrifugationasafirststepinproteinpurification4－蛋白质的分离纯化当前第30页\共有65页\编于星期五\21点密度梯度（区带）离心4－蛋白质的分离纯化当前第31页\共有65页\编于星期五\21点密度梯度（区带）离心4－蛋白质的分离纯化当前第32页\共有65页\编于星期五\21点凝胶过滤

凝胶过滤层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。4－蛋白质的分离纯化当前第33页\共有65页\编于星期五\21点凝胶过滤（分子排阻层析）基于分子大小4－蛋白质的分离纯化当前第34页\共有65页\编于星期五\21点利用溶解度差别的纯化等电点沉淀（等电点时静电荷为零，相邻蛋白质分子间没有静电斥力而趋于聚集沉淀）盐析与盐溶（中性盐可以增加蛋白质的溶解度，称为盐溶；盐析作用主要是大量中性盐争夺蛋白质疏水表面水分子）有机溶剂分级分离（有机溶剂降低蛋白质表面可解离基团的离子化程度，促进蛋白质的聚集和沉淀）4－蛋白质的分离纯化当前第35页\共有65页\编于星期五\21点利用溶解度差别的纯化分级沉淀（盐或有机溶剂）4－蛋白质的分离纯化当前第36页\共有65页\编于星期五\21点利用电荷差别的纯化聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦离子交换层析层析聚焦4－蛋白质的分离纯化当前第37页\共有65页\编于星期五\21点聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）平板电泳4－蛋白质的分离纯化当前第38页\共有65页\编于星期五\21点聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）管状电泳图谱平板PAGE图谱4－蛋白质的分离纯化当前第39页\共有65页\编于星期五\21点等电聚焦电泳蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化。在电场存在下的一定pH溶液中，带正电的蛋白分子将向负极移动而带负电的蛋白分子将向正极移动，在某一pH时，蛋白分子在电场中不再移动，此时的pH值即为该蛋白质的等电点。等电聚焦(IEF）电泳就是在凝胶中加入两性电解质从而构成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等电点。4－蛋白质的分离纯化当前第40页\共有65页\编于星期五\21点等电聚焦电泳蛋白质在具有pH梯度的介质中电泳4－蛋白质的分离纯化当前第41页\共有65页\编于星期五\21点等电聚焦电泳4－蛋白质的分离纯化当前第42页\共有65页\编于星期五\21点二维电泳1975年，O’Farrell首先运用双向电泳技术将大肠杆菌总蛋白分离出1100多个蛋白点。后来此技术一直用于原核生物和真核生物总蛋白的分离。目前，随着蛋白组工程的发展，双向电泳技术越来越广泛的用于发现未知蛋白。二维电泳由第一向等电聚焦(IEF)电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)组成，第一向使等电点不同的蛋白得到分离，第二向使分子量不同的蛋白得到分离，两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。4－蛋白质的分离纯化当前第43页\共有65页\编于星期五\21点二维电泳IsoelectricfocusingisoftencombinedwithSDStogeneratetwodimensionalgels.4－蛋白质的分离纯化当前第44页\共有65页\编于星期五\21点二维电泳的应用示例4－蛋白质的分离纯化当前第45页\共有65页\编于星期五\21点离子交换层析阳离子交换剂：CM-纤维素：-O-CH2COOHP-纤维素：磷酸基阴离子交换剂：DEAE-纤维素：二乙基氨基乙基AE-纤维素：氨基乙基4－蛋白质的分离纯化当前第46页\共有65页\编于星期五\21点离子交换层析4－蛋白质的分离纯化当前第47页\共有65页\编于星期五\21点4－蛋白质的分离纯化当前第48页\共有65页\编于星期五\21点亲和层析原理：依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离。配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合。配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体，也可以是受体、核酸、细胞器等。亲和层析是分离效率最高的分离方法。4－蛋白质的分离纯化当前第49页\共有65页\编于星期五\21点亲和层析过程示意图（1）4－蛋白质的分离纯化当前第50页\共有65页\编于星期五\21点亲和层析过程示意图（2）4－蛋白质的分离纯化当前第51页\共有65页\编于星期五\21点亲和层析过程示意图（3）4－蛋白质的分离纯化当前第52页\共有65页\编于星期五\21点亲和层析过程示意图（4）4－蛋白质的分离纯化当前第53页\共有65页\编于星期五\21点4－蛋白质的分离纯化当前第54页\共有65页\编于星期五\21点高效液相层析（HPLC）高效液相色谱（HPLC：HighPerformanceLiquidChromatography）与普通的色谱技术不同的是：填料密度高，洗脱液压力加大，分离效果更好。是化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可缺少的工具。国际市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最大的份额，增长速度最快。4－蛋白质的分离纯化当前第55页\共有65页\编于星期五\21点高效液相层析（HPLC）高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。4－蛋白质的分离纯化当前第56页\共有65页\编于星期五\21点4－蛋白质的分离纯化当前第57页\共有65页\编于星期五\21点高效液相层析（HPLC）HighPressureLiquidChromatographyHighpressurelimitsdiffusionandincreasesinteractionswithchromatographymediaHPLCgivesveryhighresolutionofproteincomponents4－蛋白质的分离纯化当前第58页\共有65页\编于星期五\21点蛋白质纯化过程实例4－蛋白质的分离纯化当前第59页\共有65页\编于星期五\21点蛋白质的含量测定凯氏定氮法双缩脲法Folin-酚法（Lowry法，蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合物，此复合物及芳香族氨基酸还原磷钼酸－磷钨酸试剂产生蓝色。）紫外吸收法Bradford法（考马斯亮蓝染料结合法）BCA法（bisinchoninicacidmethod）5－蛋白质的含量测定当前第60页\共有65页\编于星期五\21点蛋白质的纯度鉴定电泳（等电聚焦、SDS、PAGE）沉降法HPLC溶解度分析N－末端分析6－蛋白质的纯度