现代生物技术在抗生素工业中的应用

第八章现代生物技术在抗生素工业中的应用

周浓副教授

重庆三峡学院生命科学与工程学院当前第1页\共有98页\编于星期四\9点当前第2页\共有98页\编于星期四\9点当前第3页\共有98页\编于星期四\9点抗生素、氨基酸、核苷酸、维生素等基因工程药物、疫苗及抗体产品传统生物制药现代生物制药传统生物制药工业的特点产量与发酵规模大出口比重大示范效应明显当前第4页\共有98页\编于星期四\9点产业规模大2007年我国抗生素原料销售收入350多亿元，我国抗生素原料药产能、产量居世界首位产能过万吨产品：青霉素、头孢菌素、红霉素中国已经成为氨基酸生产和消费大国,年消费量约140万t左右维生素现已成为国际医药与保健品市场的主要大宗产品之一，每年维生素市值已达25亿美元，我国年产能力约20万t

大容积发酵罐当前第5页\共有98页\编于星期四\9点传统育种方法与现代生物技术

在制药工业中的比较传统的育种方法:要用经典的方法育种盲目性高不能组合不同菌株的优良性状现代生物技术:基因重组改造菌种提高产品产量改造传统的发酵生产工艺,节约能源和原料,降低污染当前第6页\共有98页\编于星期四\9点诱变育种采用诱变因子促使微生物遗传物质发生改变，从而导致其性能改善到菌种优化方法物理诱变因子紫外线、射线

化学诱变剂化学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等突变是随机过程，筛选过程大，不能增加拷贝数当前第7页\共有98页\编于星期四\9点现代生物技术：理性化育种建立在微生物生理代谢理论和抗生素合成机理基础上，有目的调节产生菌生理代谢、调节生物合成途径或改造其生物合成基因结构到育种。链霉菌为主到次级代谢产物产生菌到基因克隆表达宿主系统日益完善当前第8页\共有98页\编于星期四\9点新观点：系统代谢工程改造菌种ParkJH,etal.CurrentOpinioninBiotechnology,2008,19:454-460SystemMetabolicEngineering当前第9页\共有98页\编于星期四\9点大量引进国外高产菌株

我国至今用于大规摸工业生产的生产菌株，如青霉素、红霉素、头C、各种氨基酸、阿维霉素、泰乐霉素、黄霉素以及高表达水平的基因工程产品等几乎都是从国外高价引进。因此，从根本意义上来说，我国的传统生物制药工业和现代生物技术产业缺乏竞争力。当前第10页\共有98页\编于星期四\9点现代生物技术改造传统制药工业抗生素提高产量和改善组分产生新的杂合抗生素OlanoCetal.MetabolicEngineering2008,10:281-292.红霉素全基因组序列当前第11页\共有98页\编于星期四\9点现代生物技术改造传统制药工业氨基酸获得高产菌种缬氨酸组氨酸苏氨酸异亮氨酸缬氨酸高产菌种代谢工程改造当前第12页\共有98页\编于星期四\9点现代生物技术改造传统制药工业维生素:获得高产菌种简化生产工艺维生素C我国发明了维生素C两步发酵法，使中国维生素C生产技术居世界先进水平维生素C产量5万吨以上，占全球产量的40%当前第13页\共有98页\编于星期四\9点背景20世纪70年代,重组DNA技术兴起应用于医药蛋白多肽方面,取得了突出的效果.80年代,重组DNA技术应用于结构比较复杂的次级代谢产物的生物合成.(链霉菌)目前,抗生素生物合成酶基因的分离,质粒的选择,基因重组于转移和宿主表达.(已克隆的抗生素合成基因有23种之多)基因工程在抗生素生产中的应用当前第14页\共有98页\编于星期四\9点第一节重组DNA技术在抗生素生产中的应用重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。当前第15页\共有98页\编于星期四\9点

抗生素生物合成并非单一基因的直接产物，而是由初级代谢产物经过一系列酶催化产生的次级代谢产物，其形成过程是一个复杂的、多因素调节的过程传统的提高微生物产生抗生素能力的方法主要是用诱变剂（如紫外线、化学诱变剂等）处理微生物，获得生产能力较高的突变株。80年代，人们开始将DNA重组技术应用于次级代谢产物的生物合成上；通过生物合成酶基因的分离、质粒的选择、基因重组与转移、宿主表达等方面。当前第16页\共有98页\编于星期四\9点传统发酵法的弊端：采用经典方法育种，盲目性高，无法集合不同菌株的优良性状。基因重组技术的优点：可以定向改造菌种，且能集多个菌株的多种优良性状于同一菌株，达到简化工艺、提高产品质量和产量的目的。当前第17页\共有98页\编于星期四\9点一、克隆抗生素生物合成基因的方法1.抗生素（链霉素）生物合成基因的结构特点①链霉菌抗生素生物合成基因组的一个典型特性是G-C碱基组成，（G+C）%高达70%以上；且三联体密码子中第3个碱基G、C比例极高②抗生素生物合成基因大多处于一个基因族中③抗生素生物合成基因除定位在染色体上外，有的定位于质粒上当前第18页\共有98页\编于星期四\9点2.克隆抗生素生物合成基因的方法1）阻断变株法2）突变克隆法3）直接克隆法4）克隆抗生素抗性基因法5）寡核苷酸探针法6）同源基因杂交法7）在标准宿主系统中克隆检测单基因产物当前第19页\共有98页\编于星期四\9点1.阻断变株法阻断变株法

通过一系列阻断变株的互补结果来确定被克隆的DNA片断的性质方法与步骤

野生型突变型筛选表型恢复型分析基因总DNA基因库当前第20页\共有98页\编于星期四\9点TetracenomycinC(tamC)TetracenomycinC(丁省霉素)

是一个有淡青链霉菌产生的抗生素分离tamC—的突变株并分析阻断性质野生型总DNABamH1消化连接到pIJ702分离tamC+克隆其基因当前第21页\共有98页\编于星期四\9点2.突变克隆法ligation重组整合载体转化药物产生菌整合质粒或噬菌体DNA片段发生整合，可能干扰某生物合成基因说明这个生物合成基因发生了插入突变，这个基因就是这个生物合成相关当前第22页\共有98页\编于星期四\9点3.直接克隆法直接克隆法直接克隆整套的生物合成基因（适合于基因簇相对较小（<30kb）的抗生素生物合成基因。局限：大片段基因簇的稳定性、原始株的重要的调控因素当前第23页\共有98页\编于星期四\9点头霉素C基因的克隆筛选对C.terrigena抗性的菌株克隆其基因分别将转化子涂平板部分酶切链霉菌总DNA选择20-40kb的片段连接到pIJ943的BglⅡ位点转化变青链霉菌1326筛选转化子（不产黑色素、硫链丝菌素抗性）检测产物：TLC，HPLC等。当前第24页\共有98页\编于星期四\9点根据抗生素生物合成基因和抗性基因是连锁的，表达上也是协同的，而且抗性基因比较小（1-2kb），容易检测和克隆。ligation重组载体转化抗性敏感得抗生素产生菌Vector药物产生菌DNA酶切片段分析连锁得生物合成基因probe产生菌genomeabankhybrid分离与之同源并带有生物合成基因的DNA片段局限：有些抗生素不与合成基因连锁，并且可能抗性不止一个，所以分析比较复杂。4.克隆抗生素抗性基因法当前第25页\共有98页\编于星期四\9点红霉素生物合成基因的克隆

得到阳性克隆分析表明：片段为35kb，含有所有红霉素生物合成基因和抗性基因Mbo1酶切产生菌总DNA与穿梭粘粒pKC462a连接分析片段转导大肠杆菌SF8形成转化子以含有红霉素抗性基因质粒pIJ43为探针进行菌落原位杂交当前第26页\共有98页\编于星期四\9点5.寡核苷酸探针法事实基础

链霉菌基因对密码子的利用有明显的不随机性，即DNA中G+C的比例为70%以上，密码子第三位有90%以上为G或C原理

分离抗生素生物合成酶后，获得这些酶的氨基酸序列，根据氨基酸序列推倒出较低程度简并性的基因序列，人工合成寡核苷酸探针，从基因文库中就可克隆生物合成基因当前第27页\共有98页\编于星期四\9点6.同源基因杂交法原理

利用一种已克隆的抗生素生物合成基因片段为探针，探测相关抗生素同源基因，最后分离及克隆抗生素生物合成基因

由于基因保守序列的同源性，利用同源基因杂交法克隆化学结构类似的抗生素生物合成基因是比较快速准确的方法当前第28页\共有98页\编于星期四\9点7.在标准宿主系统中克隆检测单基因产物鸟枪克隆法把抗生素产生菌的DNA克隆到最常用的宿主——变青链霉菌中，通过检测宿主中的个别基因产物，筛选克隆，从而分离基因。利用鸟枪克隆法，把抗生素产生菌DNA克隆到最常用的宿主—变青链霉菌中，通过检测宿主菌中个别基因产物，筛选克隆，从而分离到相应的基因。当前第29页\共有98页\编于星期四\9点digestion质粒genome

ligationtransformHost-TestphenotypeShotgun当前第30页\共有98页\编于星期四\9点抗生素基因簇的组成当前第31页\共有98页\编于星期四\9点PABA合成酶基因——pab的克隆受体菌BamH1连接供体菌：过量生产PABA的磺胺抗性的灰色链霉菌总DNA筛选磺胺抗性转化子质粒转化分离基因当前第32页\共有98页\编于星期四\9点克隆抗生素所用的方法当前第33页\共有98页\编于星期四\9点二、几种典型的抗生素生物合成基因的结构红霉素:参与红霉素生物合成的基因长度为60kb，整个基因由23个ORF(openreadingframe)组成。中心部分约为35kb，称为eryA，由3个ORF（eryAⅠ，eryAⅡ，eryAⅢ）组成，主要参与内酯环的合成。eryF编码细胞色素P450单氧化酶，使6位原子羟基化；”eryB”与”eryC”是两组基因，分别与红霉素的形成和红霉内酯的3-O-红霉糖苷化有关，及与红霉糖胺的形成或3-O-红霉糖苷化有关；eryK编码C-12羟基化酶。当前第34页\共有98页\编于星期四\9点

AT-acyltransferaseACP-acylcarrierproteinKS-ketosynthaseKR-ketoreductaseDH-dehydrtaseER-enoylreductaseTE-thioesteras脱氧红霉内酯B脱氧红霉内酯B的生物合成ORF1ORF2ORF3当前第35页\共有98页\编于星期四\9点

青霉素：pcbC基因编码异青霉素N合成酶，通过“反向遗传学”方法克隆IPNS的N末端氨基酸序列，根据已知的氨基酸序列，以合成的寡核苷酸为探针，通过杂交来识别含有相关DNA序列的克隆体，经DNA序列分析发现了一个可读框，并能在大肠杆菌中表达，这种重组大肠杆菌可产生IPNS，故证实已克隆到了pcbC基因。当前第36页\共有98页\编于星期四\9点按硫代模板机制进行。ACV合酶合成δ-氨基己二酸-半胱氨酸-D-缬氨酸三肽。由IPN合酶催化形成异青霉素N。

++ACV合酶异青霉素NIPN合酶δ-氨基己二酸-半胱氨酸-D-缬氨酸三肽异青霉素的生物合成当前第37页\共有98页\编于星期四\9点青霉素和头孢菌素的生物合成当前第38页\共有98页\编于星期四\9点三、提高抗生素产量的方法经典方法通过物理或化学手段进行诱变育种得到高产菌株基因工程方法定向改造基因提高基因的表达水平改造菌种生产能力当前第39页\共有98页\编于星期四\9点提高抗生素产量在工业上改良微生物工业菌种，提高抗生素产量主要依赖物理化学手段进行诱变育种，但是利用基因工程手段有目的地定向改造基因，提高基因表达，以及改造菌种生产能力具有极大发展潜力。当前第40页\共有98页\编于星期四\9点原理：在克隆菌株中，增加某一与产量有关的基因（限速阶段的基因或正调节基因）剂量，使产量提高。方法1：将产生菌基因随机克隆至原株直接筛选高产菌株当前第41页\共有98页\编于星期四\9点抗生素合成途径中的某个阶段可能是整个合成中的限速阶段，识别位于合成途径中的“限速瓶颈”，并设法倒入能提高这个阶段酶系的基因拷贝数，就有可能增加最终抗生素的产量。故增加生物合成中限速阶段酶基因剂量有可能提高抗生素产量。抗生素合成途径中的代谢支路的关键基因消除，提高红霉素合成流量方法2：增加和敲除合成途径的关键基因当前第42页\共有98页\编于星期四\9点增加生物合成限速酶系编码基因的拷贝数Methylmalonyl-CoA(mmCoA)metabolitenodeinerythromycinbiosynthesis当前第43页\共有98页\编于星期四\9点开源：强化红霉素合成甲基丙二酰CoA代谢节点拷贝甲基丙二酰CoA变位酶（MCM）操纵子，红霉素产量增加50%。ReevesAR,etal.MetabolicEngineering,2007,9:293-303.当前第44页\共有98页\编于星期四\9点节流：克拉维酸合成中3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因敲除LiRFetal.MetabolicEngineering,2006,8:240-252.当前第45页\共有98页\编于星期四\9点当前第46页\共有98页\编于星期四\9点依据在许多链霉菌中，调节基因嵌在控制抗生素产生的基因簇中正调节基因对结构基因进行正向调节负调节基因对结构基因进行负向调节

将额外的正调节基因引入野生型菌株中，使获得高产产物的最简单的方法增加正性调节基因或降低负性调节基因也是增加抗生素产量的方法方法3：通过调节基因的作用当前第47页\共有98页\编于星期四\9点红霉素合成调节基因bldD的发现ChngC,etal.PNAS,2008,105:11346-11351当前第48页\共有98页\编于星期四\9点美伐他汀合成调节基因mlcR的强化表达降血脂药物ApplMicrobiolBiotechnol(2009)83:697–704当前第49页\共有98页\编于星期四\9点事实依据1、抗生素的生产水平是由抗生素生物合成酶和对自身抗性的酶所共同决定的2、抗性基因经常和生物合成基因连锁，是激活生物合成基因基因转录的必需成分3、抗性基因必需先转录，建立抗性后，生物合成基因的转录才能进行所以可以通过提高菌种自身的抗性水平来改良菌种，提高抗生素产量。

方法4：增加抗性基因当前第50页\共有98页\编于星期四\9点链霉素抗性筛选法在选育博来霉素A2组分高产菌株中的应用中国医药工业杂志,2007,38(5):344-346当前第51页\共有98页\编于星期四\9点四、改善抗生素组分例:阿维菌素选育只能生产B2a的菌株是十分有意义的基因工程在抗生素生产中的应用多组分，生理活性上，相差大。应用基因工程方法，可以定向的改造抗生素产生菌，获得只产生有效组分的菌种。当前第52页\共有98页\编于星期四\9点当前第53页\共有98页\编于星期四\9点当前第54页\共有98页\编于星期四\9点红霉素基因工程技术

现状次级代谢产物的复杂代谢调控机制分子改造局限于模式生物，缺乏工业生产菌株的应用，国内外没有报道红霉素生物合成途径7264个基因，多基因簇

当前第55页\共有98页\编于星期四\9点A（76.8%）B（3.9%）C（4.4%）原生产菌株HPLC组分图当前第56页\共有98页\编于星期四\9点红霉素生物合成途径的复杂性当前第57页\共有98页\编于星期四\9点1丙酸＋6甲基丙二酸PKSeryA6-脱氧红霉内酯（6-dEB）eryFC-羟化酶红霉内酯（EB）L-mycarose糖基转移酶eryB3-L-mycarose红霉内酯MEBD-desosamine糖基转移酶eryC红霉素D（ErD）C-12羟化酶eryK红霉素C（ErC）eryG红霉素A（ErA）甲基化酶eryG红霉素B（ErB）C-12羟化酶eryK红霉素F（ErF）红霉素E（ErE）甲基化酶当前第58页\共有98页\编于星期四\9点围绕红霉素菌种改造的工作

研究内容：调节羟化酶（eryK）和甲基化酶（eryG）表达，优化红霉素D转化为红霉素A两条代谢途径的通量分布当前第59页\共有98页\编于星期四\9点几种基因操作后获得的不同突变株情况汇总ChenYetal.ApplEnviron.Microbiol.2008,6:1820-1828.当前第60页\共有98页\编于星期四\9点基因工程菌发酵基因工程菌红霉素组分跟踪

50L发酵罐发酵批次数据

基因工程菌多参数相关分析现生产菌种6742162

1232

当前第61页\共有98页\编于星期四\9点五、改进抗生素生产工艺氧：将血红蛋白基因克隆到放线菌中，促进有氧代谢、菌体生长和抗生素合成。传统方法：对发酵罐进行改造（成本高，利用率小）基因工程在抗生素生产中的应用基因工程方法：引入血红蛋白基因到产生菌中，在细胞中表达血红蛋白，从提高细胞自身代谢功能解决溶氧供求矛盾透明颤菌血红蛋白（VitreoscillahemolobinVHb)对氧的亲和力提高，临界氧下降DOOURCLCVHB当前第62页\共有98页\编于星期四\9点透明颤菌血红蛋白基因在产黄青霉中的克隆与表达产黄青霉生物量提高9.76%，青霉素产量提高了9.68%中国抗生素杂志，2006，7：400-402.当前第63页\共有98页\编于星期四\9点六、产生杂合抗生素组合生物合成：利用生物合成酶基因的底物宽容性及其相互作用进行生物合成酶基因的重组、组合、互补、替换等操作，以产生新结构化合物。与原有化合物相比，这些新化合物的结构改变可以发生在母核上，也可以发生在母核的修饰上。用途

♪为功能化合物包括新药的筛选提供人工“天然产物”库♫定向改造已有功能化合物提供了绿色途径。当前第64页\共有98页\编于星期四\9点1.基因重组当前第65页\共有98页\编于星期四\9点2.酶基因突变当前第66页\共有98页\编于星期四\9点3.引入酶基因当前第67页\共有98页\编于星期四\9点4.酶催化形成新产物

当前第68页\共有98页\编于星期四\9点组合生物合成操作策略当前第69页\共有98页\编于星期四\9点红霉素的组合生物合成当前第70页\共有98页\编于星期四\9点当前第71页\共有98页\编于星期四\9点红霉素组合生物合成：新化合物BasnetDB,etal.J.Biotechnol.2008,135:92-96.当前第72页\共有98页\编于星期四\9点必特螺旋霉素简介利用组合生物合成技术将碳霉素产生菌的4”-异戊酰转移酶基因（carE）克隆到螺旋霉素产生菌Streptomycesspiramyceticus

F21中而获得的基因工程杂合抗生素我国第一个基因工程抗生素，目前已作为一类新药进入二期临床药效学：表明必特螺旋霉素的抗菌活性及治疗效果优于乙酰螺旋霉素、麦迪霉素和红霉素。当前第73页\共有98页\编于星期四\9点必特螺旋霉素结构

R：HCOCH3COCH2CH3R’：COCH2CH(CH3)2

COCH2CH2CH3COCH2CH3COCH2CH3COCH3当前第74页\共有98页\编于星期四\9点第二节

基因工程技术在新药研究中的应用当前第75页\共有98页\编于星期四\9点靶酶当前第76页\共有98页\编于星期四\9点受体当前第77页\共有98页\编于星期四\9点第三节细胞工程在传统制药工业中的应用当前第78页\共有98页\编于星期四\9点当前第79页\共有98页\编于星期四\9点当前第80页\共有98页\编于星期四\9点抗生素类药物总结

一、定义

瓦克斯曼于1942年首先给抗生素下了一个明确的定义：抗生素是一个低分子量的微生物代谢产物，在低浓度时（低于1mg／mL）能抑制其他微生物生长。81当前第81页\共有98页\编于星期四\9点抗生素半合成抗生素次级代谢产物当前第82页\共有98页\编于星期四\9点抗感染药物抗菌药物化学治疗药（化疗药）当前第83页\共有98页\编于星期四\9点化疗提出者：保罗.恩利希（德国，1911）当前第84页\共有98页\编于星期四\9点走出“化疗就是肿瘤化疗”的误区当前第85页\共有98页\编于星期四\9点如果说，原子弹是第二次世界大战中杀伤力量最强的武器，那么，青霉素就是从这个战场拯救生命最多的药物。难怪有人把原子弹、雷达和青霉素并列为第二次世界大战期间的三大科学发明。1942年美国制药公司对青霉素进行批量生产。1944年用于二战盟军青霉素终于在1943年问世86当前第86页\共有98页\编于星期四\9点S.A.SelmanAbrahamWaksman(1888～1973)

乌克兰裔美国生物化学家土壤微生物学家

1952年获得诺贝尔奖瓦克斯曼抛弃了传统的靠碰巧来分离抗生素的方法，开始通过筛选成千上万的微生物来有意识、有目的地寻找抗生素。瓦克斯曼被称为抗生素之父。瓦克斯曼.S.A87当前第87页\共有98页\编于星期四\9点抗生素类药物研制的历史青霉素G19291958年batchelor分离6－APA，半合成青霉素头孢菌素C1961年链霉素（1944）氯霉素（1947）红霉素（1952）万古霉素（1956）金霉素土霉素四环素（1948）（1950）（1952）半合成四环素类半合成红霉素类利福霉素（1958）卡那霉素（1958）庆大霉素（1963）利福平氨基糖苷类

β—内酰胺类氯霉素全合成（1949）881961年AbraHAM分离7－ACA，半合成头孢菌素多粘菌素B（1947）新霉素（1948）林可霉素（1962）当前第88页\共有98页\编于星期四\9点二、产生菌目前已知的天然抗生素不下万种。主要来源于:放线菌来源：其中近半数为放线菌所产生，其中主要是链霉菌属。如链霉素、金霉素、红霉素、创新霉素、争光霉素和春雷霉素等；细菌来源：细菌所产生的有杆菌肽、短杆菌肽、多粘菌素等；真菌来源（青霉菌和黑曲霉菌）：真菌所产生的有青霉素、灰质霉素等。89当前第89页\共有98页\编于星期四\9点三、生物合成以生物合成途径为基础，抗生素可划分为：1.一级代谢的同系物(氨基酸、核苷酸、辅酶等同系物)，这些小分子，生物合成的方式和结构上与一级代谢相似。2.由聚合作用产生的抗生素。90当前第90页\共有98页\编于星期四\9点2.由聚合作用产生的抗生素（1）多肽类抗生素及其衍生物，是由一些氨基酸聚合形成多肽链，再进一步进行改造。（2）由乙酸和丙酸单位衍生的抗生素，包