现代微生物遗传学第三章质粒

第一节质粒的发现和命名质粒：存在于细菌、真菌等微生物细胞中、独立于染色体外、能进行自我复制的遗传因子。对于宿主，一般是非必需的通常是共价(covalent)、闭合(closed)、环状(circular)双链DNA.(但也有例外：线状DNA，RNA)附加体：整合在染色体上，或游离，并能携带宿主的染色体基因。当前第1页\共有28页\编于星期四\9点一、质粒的发现F质粒(1946年)，第一个被发现的质粒20世纪50-70年代：抗性质粒的大量研究，以及其他质粒的发现20世纪70年代后，质粒广泛应用于遗传工程和分子生物学研究中。当前第2页\共有28页\编于星期四\9点二、质粒的命名原则最初发现的质粒由研究者根据表型、大小等特征自行命名。(F因子、R质粒、Col质粒等)1976年Novick提出了质粒命名原则：质粒名称一般由三个英文字母及编号组成；第一个字母一律小写p表示（plasmid）后两个字母要大写，可以采用发现者人名、实验室名称、表型性状或其他特征的英文缩写。编号为阿拉伯数字，用于区分同一类型的不同质粒。(pUC18,pUC19等)当前第3页\共有28页\编于星期四\9点第二节质粒编码的遗传表型大多数质粒均控制着宿主细胞的一种或几种特殊性状，具有一定的表型，质粒可依据其表型不同可划分为以下几类：1.致育质粒2.抗药性质粒组成：转移区和抗性决定子抗药的机制：改变抗生素作用的靶点；修饰抗生素；组织抗生素进入；产生一种酶能代替宿主细胞中被抗生素作用的靶点。当前第4页\共有28页\编于星期四\9点3.产生抗生素的质粒细菌素：细菌产生的一般只能抑制或杀死种内不同亚种或菌株中敏感细菌的特殊多肽类代谢产物。Col质粒：10种，有非接合型和接合型之分。4.产生毒性的质粒(BT)5.降解质粒：假单胞菌属是一类能广泛利用有机化合物进行生长的细菌。其体内含有大量的降解质粒。6.致病性质粒：根癌土壤农杆菌的Ti质粒；以及破伤风梭菌、肉毒梭菌和大肠杆菌等都存在致病性质粒。当前第5页\共有28页\编于星期四\9点7.共生固氮质粒根瘤菌普遍喊有该类质粒。包括共生质粒和非共生质粒，非共生质粒对共生作用可有正或负的调节作用。8.隐蔽质粒(crypticplasmid)酵母的2m质粒（p171）长为2m的6kb的环状双链DNA分子位于酵母细胞核内，50~100拷贝只携带与复制和重组有关的4个基因，无遗传表型质粒上有两个600bp长的IR，被一个2.7kb区域和一个2.3kb小区域所间隔两个IR上都有一个专一重组位点(FRT)，经过重组，可使质粒互变异构成A型和B型。当前第6页\共有28页\编于星期四\9点第三节质粒的检测检测质粒的方法主要根据质粒的（遗传学特性）和（分子结构特性）。遗传特性：独特的表型、转移、人为消除等。分子结构：cccDNA和染色体相比对理化因子有更强的抗性。当前第7页\共有28页\编于星期四\9点一、质粒消除（理化因子和生物学方法）理化因子消除法消除剂：吖啶类，EB，某些抗生素，高温，UV等如何判断某一遗传性状的丧失是质粒消除的结果还是染色体基因突变的结果呢？回复突变情况突变率理化因子消除质粒的作用机制：对质粒本身的复制和分离产生抑制作用，在生长中被淘汰选择性抑制带有质粒的菌的生长。当前第8页\共有28页\编于星期四\9点2.原生质体消除法使待消除质粒的菌株在一定条件下形成原生质体，在再生后生长的菌株中可出现高频率质粒消除菌。当前第9页\共有28页\编于星期四\9点二、遗传转移将质粒导入已经消除了该质粒的原宿主细胞，比较导入前后表型性状的差异或恢复程度。三、分子杂交在初步确定某菌株可能含有质粒的情况下，利用已知表型性状的基因片段作探针进行分子杂交，来检测其菌株是否含有该种质粒。当前第10页\共有28页\编于星期四\9点四、质粒的分离、检测与纯化质粒分离方法：碱变性法菌体的培养和收集溶菌碱变性处理离心分离有时为了快速提取质粒DNA，可以在提取液碱变性后，用pH4.8的醋酸钠高盐缓冲液调节pH到中性，这时染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，而即使变性的质粒可以恢复到原来的构型，再通过离心，这样可以缩短提取质粒的时间。当前第11页\共有28页\编于星期四\9点纯化和检测方法琼脂糖凝胶电泳(质粒3种构型泳动速度不同，琼脂糖浓度，EB染色，分子量的判断)氯化铯-EB密度梯度离心电镜观察当前第12页\共有28页\编于星期四\9点第四节质粒的复制与调节一、质粒的大小和拷贝数1.大小测定表示方式：MD或kb，1MD的双链DNA≈1.65kb。测定方法：电泳、电镜、测序。大小范围：1~200kb，个别800~1000。2.质粒的拷贝数严紧型质粒(stringentplasmid)或低拷贝质粒；松弛型质粒(relaxedplasmid)或高拷贝质粒。（氯霉素可抑制细胞分离，终止染色体复制，但松弛型质粒可持续复制，其拷贝数可达到1000~3000）。当前第13页\共有28页\编于星期四\9点二、质粒的复制1.质粒复制的方式(P120)质粒的复制起点称为oriV,大肠杆菌为oriC。复制主要通过型复制和滚环复制之一进行。其中以型复制为主（包括单向和双向）。质粒只编码一种或少数几种与复制有关的蛋白质，其他复制蛋白都来自宿主。当前第14页\共有28页\编于星期四\9点2.复制起点区oriV的功能和pBR322质粒复制起点区oriV功能与质粒载体的构建、寄主范围pBR322质粒：pMB1的ori和rop（ROP蛋白对质粒的复制负调控）区；pSC101的tetr；Tn3的ampr。属中等拷贝质粒，10~30个/细胞pUC类：高拷贝质粒（100~300个/细胞），也是pMB1的ori，但是没有rop。当前第15页\共有28页\编于星期四\9点质粒的寄主范围和质粒的拷贝数均决定于质粒的ori区域。当前第16页\共有28页\编于星期四\9点三、质粒复制的调控质粒的调控一般采用直接或间接的负调控机制。负调控因子可是蛋白质、RNA或DNA重复序列。调控类型可分两类：抑制物-靶位调控(inhibitor-targetregulation)重复子-竞争结合调控(iteron-bindingregulation)当前第17页\共有28页\编于星期四\9点1.抑制物-靶位调控依赖一小段反向转录的RNA作为抑制物，通过它与质粒DNA复制引物或编码Rep蛋白（复制蛋白）的mRNA的互补结合以阻止质粒复制的起始。(1)ColE1质粒复制调控（P122图5-7）当前第18页\共有28页\编于星期四\9点抑制物（负调控因子）：反义RNA、Rop蛋白靶位：质粒复制的前提引物机制：反义RNA和引物RNA互补结合，阻止其发挥作用；Rop蛋白具有强化反义RNA和引物RNA结合的作用。是抑制物对靶位的直接调控模型。当前第19页\共有28页\编于星期四\9点(2)R1质粒的复制调控抑制物通过抑制Rep蛋白的形成而阻止了该蛋白对oriV的激活作用。是间接调控模型。抑制物：CopB蛋白：是PrepA启动子的阻遏蛋白；copA基因转录产物RNA：Rep蛋白mRNA互补，抑制其合成靶位：Rep蛋白的合成当前第20页\共有28页\编于星期四\9点2.重复子-竞争结合调控采用该机制进行调控的质粒为重复子质粒。在复制起始位点ori和复制基因rep附近存在着多个长度为17~22bp的DNA短片段。这些短片段叫重复子。重复子能与复制必需的Rep蛋白竞争性结合，从而抑制了质粒的复制和拷贝数的增加。pSC101、F、P1等都属于重复子质粒。当前第21页\共有28页\编于星期四\9点重复子质粒复制调控机制（两种,p124-125）(1)转录自体调控：RepA蛋白通过与自身启动子区的某些序列（如pSC101中的反向重复序列IR1和IR2）的结合而抑制自身的合成，这种方式叫做转录自体调控。当前第22页\共有28页\编于星期四\9点(2)偶联模型调控：由于重复子序列间的相互作用使两个质粒偶联在一起，从而抑制了质粒复制的起始，该方式即为偶联模型。质粒浓度低时，RepA蛋白只与一个质粒结合；质粒浓度高时，RepA蛋白通过与重复子序列的结合使两个质粒联结在一起，阻止质粒的复制。当前第23页\共有28页\编于星期四\9点F质粒的复制调控F质粒的复制区也含有19~22bp的重复序列，repE基因编码的RepE蛋白也是质粒复制所必需的。RepE蛋白是一种自体调控蛋白，可能也是通过与自身启动子结合对自身浓度进行调控。RepE蛋白通过与重复子序列结合抑制质粒复制。当前第24页\共有28页\编于星期四\9点四、质粒之间的不相容性不相容性(incompatibility):亲缘关系相近的两种质粒，在非选择性条件下不能稳定存在于同一个细胞中，该种特性为质粒的不相容性。与质粒的复制起始的控制密切相关。同种质粒的衍生物总是不相容的；不同质粒的衍生物可能相容，也可能不相容。不相容群(incompatibilitygroup)：不能在同一个细胞中同时稳定存在的质粒属于一个不相容群。因此，不同的不相容群的质粒能同时稳定存在于一个细胞中。当前第25页\共有28页\编于星期四\9点五、质粒的稳定性质粒的不稳定性包括：分离的不稳定性和结构的不稳定性。质粒分配到子细胞中的途径包括：主动分配(activedistribution)和随机分配(randomdistribution)两种方式。当前第26页\共有28页\编于星期四\9点1.主动分配机理该类质粒一般为低拷贝质粒。其稳定性通过质粒编码的基因产物来实现，包括编码主动分配体系的par区和致死基因。par区：即分配区partitionregion，指在细胞分裂过程中使质粒拷贝数均等分配到子细胞中的质粒DNA序列。质粒的复制与分配是分开独立进行的。当前第27页\共有28页\编于星期四\9点F质粒的par区结构和分配机理结构（p128图5-13）：反式作用基因(sopA,sopB)，顺式作用位点(sopC)。机理：so