第三部分细胞工程

第三部分细胞工程第一页，共六十四页，编辑于2023年，星期一

以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动、植物个体，或获得某种有用的物质的过程。第二页，共六十四页，编辑于2023年，星期一1、植物组织培养：

用无菌方法，使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的培养技术的总称。2、外植体：

由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官。一、植物组织培养中的几个基本概念第三页，共六十四页，编辑于2023年，星期一3、植株培养：

以具备完整植株形态的材料（如幼苗和较大的植株）为外植体的无菌培养。4、胚胎培养：

以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。第四页，共六十四页，编辑于2023年，星期一5、器官培养：

以植物的根、茎、叶、花、果等器官为外植体的离体无菌培养。6、组织培养：

以分离出植物各部位的组织（如分生组织形成层、木质部、韧皮部、表皮、皮层、胚乳组织、薄壁组织、髓部等），或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。第五页，共六十四页，编辑于2023年，星期一二、细胞工程的分类根据研究对象的不同：1）植物细胞工程

2）动物细胞工程

3）微生物细胞工程第六页，共六十四页，编辑于2023年，星期一植物细胞工程包括：植物组织、器官培养技术；细胞培养技术；原生质体融合与培养技术；亚细胞水平的操作技术等。第七页，共六十四页，编辑于2023年，星期一动物细胞工程包括：

细胞培养技术（包括组织培养、器官培养）；胚胎工程技术（核移植、胚胎分割等）；

克隆技术（单细胞系克隆、器官克隆、个体克隆）；细胞融合技术。第八页，共六十四页，编辑于2023年，星期一1997年2月，英国科学家Wilmut等在世界权威杂志《Nature》上首例报道了世界第一只克隆羊的诞生。第九页，共六十四页，编辑于2023年，星期一多莉羊的培育过程卵细胞Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎卵裂C母绵羊子宫胚胎移植多莉羊分娩妊娠融合后的卵细胞第十页，共六十四页，编辑于2023年，星期一第一节细胞培养的设备

和操作技术

1、实验室的设计

2、基本操作技术

3、培养基及其配制第十一页，共六十四页，编辑于2023年，星期一一、实验室的设计第十二页，共六十四页，编辑于2023年，星期一

细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即：实验准备（培养基配制，洗涤与灭菌）；无菌操作；控制培养。第十三页，共六十四页，编辑于2023年，星期一从总体上来分，实验室主要分为两类：基本实验室：辅助实验室：实验室设计第十四页，共六十四页，编辑于2023年，星期一1、基本实验室：准备室接种室培养室第十五页，共六十四页，编辑于2023年，星期一

作用

植物细胞和组织培养所需器具的洗涤、干燥和保存；培养基的配制、分装和灭菌；化学试剂的配制；重蒸馏水的生产等。

设计要求

面积20m2左右。通风透光，地面防滑，墙面防潮。准备室第十六页，共六十四页，编辑于2023年，星期一▲实验台架▲大、小水槽▲烘箱▲冰箱▲天平系列▲

pH计▲高压消毒锅▲各种玻璃器皿▲药品柜▲（磁力）搅拌器▲电炉▲蒸馏水器

设备第十七页，共六十四页，编辑于2023年，星期一接种室

——也叫无菌操作室作用

供外植体的接种，培养物的转移和原生质体的游离培养操作之用。第十八页，共六十四页，编辑于2023年，星期一无菌室第十九页，共六十四页，编辑于2023年，星期一设计要求

墙壁光滑平整，地面平坦无缝，除出入口和通气口外，应当密闭，空气不能对流，或者空气经净化后进入室内。无菌室旁边应设有缓冲间，缓冲间内应有紫外灯，随时可进行灭菌。第二十页，共六十四页，编辑于2023年，星期一

无菌室内的日常灭菌：定期用甲醛和高锰酸钾混合后熏蒸，产生大量蒸汽，杀灭微生物。

使用前处理：用新洁尔灭（1：50）擦净，然后用紫外灯照射灭菌至少20分钟，操作前用70%酒精喷雾。第二十一页，共六十四页，编辑于2023年，星期一设备△紫外光灯△空调△放物架（或医用小平车：推送、放置培养基用；）△无菌操作用的器具：酒精灯、70%酒精消毒棉、解剖刀、弓背镊子、解剖针、剪刀等。第二十二页，共六十四页，编辑于2023年，星期一△超净工作台：内设紫外灯、吹风装置、过滤装置等每次实验前要用紫外灯灭菌20分钟以上，然后喷酒精灭菌，工作过程中注意一直开着吹风机，并且一定要关掉紫外灯，过滤网应经常清洗。第二十三页，共六十四页，编辑于2023年，星期一其它部件：△离心机：分离原生质体用；△点融合仪：细胞融合用。第二十四页，共六十四页，编辑于2023年，星期一3培养室第二十五页，共六十四页，编辑于2023年，星期一

离体组织和试管苗生长发育的场所，应为培养物创造适宜的温、光、气等条件。设计要求

培养室内要求内壁保温、光滑、室顶高2.6m左右，易于控制温、湿度，窗上要求装双层密封玻璃窗，室内有足够电源。

作用第二十六页，共六十四页，编辑于2023年，星期一设备△

空调机：冷暖型△

加热器△

定时装置：控制光照时间△

培养架：放置培养瓶△

摇床和转床：悬浮培养△

各种光质灯管：光照培养△

温度计：控制温度△

遮光帘：供暗培养之用第二十七页，共六十四页，编辑于2023年，星期一2、辅助实验室：细胞学实验室摄影室及暗室生化分析室第二十八页，共六十四页，编辑于2023年，星期一细胞学实验室主要设备

各种显微镜，显微照相设备，切片、制片仪器设备，染色用具，暗房设备等。

作用

植物组织和细胞培养过程中，需随时观察记录其细胞学和形态解剖学的变化，故要设置细胞显微观察室。第二十九页，共六十四页，编辑于2023年，星期一第三十页，共六十四页，编辑于2023年，星期一理化分析试验室第三十一页，共六十四页，编辑于2023年，星期一二、基本操作技术第三十二页，共六十四页，编辑于2023年，星期一

基本操作技术主要是围绕无菌操作技术展开的一系列操作技能，内容主要包括：一．洗涤技术二．灭菌、消毒技术三、培养基配置技术四、接种技术第三十三页，共六十四页，编辑于2023年，星期一（一）、洗涤技术、洗涤目的：去除杂物，降低带菌量、根据洗涤对象的不同，主要分为：器皿洗涤（包括玻璃、塑料、搪瓷、不锈钢器皿）培养材料洗涤第三十四页，共六十四页，编辑于2023年，星期一

一）器皿洗涤根据洗涤对象的具体情况可分为以下三种：特殊洗涤微生物大量污染的洗涤常规洗涤第三十五页，共六十四页，编辑于2023年，星期一

常规洗涤△

自来水洗去油渍、霉菌等脏物；△温肥皂水中浸泡一定时间后用刷子刷净；△自来水冲洗干净，至瓶壁不挂水珠为止；△蒸馏水淋洗内外壁△将玻璃器皿倒置：晾干或烘干（50～75℃）△放入除尘柜中备用第三十六页，共六十四页，编辑于2023年，星期一

微生物大量污染的洗涤△

微生物污染器皿加压灭菌后再洗涤特殊洗涤（如沾有蛋白质类物质或其它有机物时)△

经过常规洗涤未过蒸馏水的器具，浸泡入洗液（铬酸洗涤液是用重铬酸钾(K2Cr2O7)与硫酸(H2SO4)配制而成）中数分至数小时；△

回收洗液，器具先用自来水洗净，蒸馏水淋洗，烘干（75℃）第三十七页，共六十四页，编辑于2023年，星期一

二）、试验材料的清洗

清洗目的：来自自然界的试验材料，包括来自土壤中的幼茎、磷茎，滋生着各种微生物，尤其是细菌的芽孢和真菌的孢子，一旦与培养基接触，就会很快的繁殖起来，造成培养基和培养材料的污染。

清洗方法：先用自来水冲洗5分钟，然后用中性洗涤剂清洗，注意勿损伤试验材料。再用自来水流水冲洗半小时，用于下一步的药剂灭菌。第三十八页，共六十四页，编辑于2023年，星期一（二）、灭菌、消毒技术

一）关于有菌和无菌的概念有菌的范畴：

凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的，如植物的表面、超净工作台的台面，未处理的工具和手等。第三十九页，共六十四页，编辑于2023年，星期一

高压高温处理（工具、器皿、培养基等）物理或化学处理；火烤后的物体；健康的动植物不与内外部表面接触的组织内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但不会影响培养，也不会污染）无菌的范畴：第四十页，共六十四页，编辑于2023年，星期一

二）灭菌、消毒技术作用和意义

植物组培中，凡用于培养和无菌操作的房间、器具、培养瓶、培养基，培养材料和操作者的衣物和手都应随时进行灭菌，以确保不受杂菌污染，否则，由于杂菌的生长繁殖速度一般都比培养的组织快得多，最终将把组织全部杀死，这些污染微生物还可能排泄对植物组织有毒的代谢废物，因此在培养容器内部保持一个完全无菌的环境是绝对必须的。第四十一页，共六十四页，编辑于2023年，星期一

三）灭菌、消毒种类物理方法：

物理灭菌：高温高压灭菌（干热/湿热）、烘烤或灼烧灭菌、射线处理、超声波等

物理除菌：过滤（0.25微米）、离心沉淀等；化学方法：使用灭菌剂，如薰蒸灭菌、消毒液灭菌（酒精、升汞、苯酚、漂白精、新洁尔灭、次氯酸钠、过氧化氢）第四十二页，共六十四页，编辑于2023年，星期一消毒、灭菌的对象：

★接种室

★材料（外植体）：★器皿用具消毒（灭菌）★培养基第四十三页，共六十四页，编辑于2023年，星期一

四）、培养基、器具的灭菌

用灭菌锅灭菌：一般121℃，灭菌20分钟。自动锅：加足水后，调好时间、温度、即可自动运转。

手动锅：加足水后，关好，通电。待压力升到0.5kg／C㎡时，打开排气阀排除锅内的冷空气。然后关闭排气阀，升至1.1kg／C㎡(121℃左右)时计时，用通电、断电来保持20分钟。后断电待压力降至时取出。

器具的灭菌：也可用烘箱160℃，90～120分钟第四十四页，共六十四页，编辑于2023年，星期一

五）、过滤除菌培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培养基中某些成分遇到高温分解（如某些激素GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌或者两者结合。另外酶等也需要过滤灭菌；

灭菌方法：将激素或酶配成一定浓度，用注射器过虑，0.2－0.25微米。配制培养基时，先将培养基高压灭菌，待温度降至50℃左右时，加入适量的已过虑除菌的激素等，然后分装。第四十五页，共六十四页，编辑于2023年，星期一

六）、外植体的消毒：

取材将老的组织去掉自来水冲洗清洁剂水洗（简单杀菌）自来水冲洗

70％酒精处理消毒剂处理灭菌蒸馏水冲洗3－5遍。

消毒时间，因材料老嫩程度不同有所不同。一般，较老的材料相对杀菌时间较长，反之，较短。一般杀菌，酒精10秒，升汞5－12分钟。第四十六页，共六十四页，编辑于2023年，星期一消毒剂

使用浓度(％)消毒时间(分)效果残液去除难易次氯酸钙105～30好易次氯酸钠

2～55～30好易新洁尔灭10～205～30好易氯化汞

0.1～12～10最好最难过氧化氢10～125～15较好最易抗菌素4～50mg/L30～60较好较难几种常用消毒剂的效果比较第四十七页，共六十四页，编辑于2023年，星期一根据离体培养的营养需求，培养基至少包括：

无机盐；

有机化合物；

生长调节剂（三）、培养基及其配制第四十八页，共六十四页，编辑于2023年，星期一一）、培养基的基本成分Fe、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、B1无机营养物质、大量元素：C、H、ON、P、K、Ca、Mg、S、(Na)、微量元素：第四十九页，共六十四页，编辑于2023年，星期一无机盐的作用：一是组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；二是构成一些特殊的生理活性物质，如植物激素、酶以及酶的活化剂，参与植物的代谢活动；三是这些元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等生物电化学方面的作用；四是在发育过程中，影响组织器官的建成。第五十页，共六十四页，编辑于2023年，星期一浓度：2%-3%2有机物质糖：作用：维持培养基合适的渗透压为细胞提供合成新物质的碳骨架为细胞的呼吸代谢提供底物和能量种类：蔗糖、葡萄糖麦芽糖、果糖等多糖：可溶性淀粉第五十一页，共六十四页，编辑于2023年，星期一生理活性物质维生素：

种类：硫胺素(VB1)、烟酸（VB3）、泛酸(VB5)、吡哆醇(VB6)、酸铵、钴胺素(VB12)、叶酸(VM又称VB11)、抗坏血酸(VC)等.作用：利于细胞代谢和器官分化。B1是植物组培必须加入的维生素，其用量在0.1-30mg/L之间，当组培中细胞分裂素特别少时，B1更为需要；烟酸和B6可促进细胞生长。第五十二页，共六十四页，编辑于2023年，星期一3、生长调节剂（激素）

在培养基中，其各种成分对培养物影响最大的最显著的就是激素。激素的种类、浓度、以及配比都会显著的影响愈伤组织的形成、不定根、不定芽的分化，胚状体的形成等；

组织培养中使用的激素有的是天然的，如脱落酸（ABA）等，有的是合成的，如二氯苯氧乙酸（2，4－D）。第五十三页，共六十四页，编辑于2023年，星期一生长调节剂种类1、生长素2、细胞分裂素3、赤霉素:GA34、脱落酸：ABA5、其它：如乙烯第五十四页，共六十四页，编辑于2023年，星期一常用的生长素有：

二氯苯氧乙酸（2，4－D）

；

萘乙酸（NAA）

吲哚乙酸（

IAA）

；

吲哚－3－丁酸（IBA）

萘氧乙酸（NOA）

；

对氯苯氧乙酸（P-CPA）

三氯苯氧乙酸（2，4，5－T）；

生根粉（ABT）如：NAA、IAA、

IBA易引起生根，

2，4－D、2，4，5－T有利于愈伤组织的诱导和生长。第五十五页，共六十四页，编辑于2023年，星期一主要作用：是诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生以及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产生；作用的强弱顺序为：

2，4-D>NAA>IBA>IAA第五十六页，共六十四页，编辑于2023年，星期一常用的细胞分裂素有：

6－苄基嘌呤（BAP）；

6－苄基腺嘌呤（6－BA）；

激动素（呋喃氨基嘌呤、Kinetin、KT）；

玉米素（ZT）；

异戊烯氨基嘌呤（2－IP）

噻二唑苯基脲（thidiazuron、TDZ）；

溶解方法：0.1MHCL

保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存第五十七页，共六十四页，编辑于2023年，星期一主要作用：促进细胞的分裂和器官的分化、延缓组织的衰老、增强蛋白质的合成、抑制顶端优势、促进侧芽的生长及显著改变其他的激素作用；作用的强弱顺序为：ZT>2-iP>6-BA>KT。第五十八页，共六十四页，编辑于2023年，星期一作用：提供一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素等。这类物质常指天然提取物：

麦芽提取物、

椰乳、

鲜果汁、

酵母提取物4、其它有益有机添加物或未知复合成分第五十九页，共六十四页，编辑于2023年，星期一琼脂:是从海藻中提取的一种高分子碳水化合物，其主要作用是使培养基在常温下凝固，但不参与代谢。

活性炭:主要目的是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响，如可以防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。

5、附加物