第三章高效液相色谱

第三章高效液相色谱第一页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一本章内容：高效液相色谱概述高效液相色谱仪高效液相色谱的分类高效液相色谱分析方法高效液相色谱仪的维护与保养高效液相色谱商品仪器及厂商第二页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一一、概述概念特点应用第三页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一

高效液相色谱(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)一般指采用高压输液泵、高效分离柱、高灵敏检测器等仪器装置，具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度高和应用范围广的一类液相色谱分析方法。第四页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一高效液相色谱和经典液相色谱的比较

“三高”“一快”“一广”高柱效——n=104片/米，柱效高（远高于一般LC）高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广泛（可分析80%有机化合物）第五页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一色谱柱流动相的推动力检测方式

粗粒多孔固定相，大口径、长玻璃柱管全多孔微粒固定相，小口径，短不锈钢柱管

HPLC依靠重力让溶剂流下，分离速度慢，分析时间长(1～20h)

采用高压泵输送流动相，可准确控制流速，分析速度快(0.05～1h)HPLC用于混合物的分离，一般分离和检测过程独自将柱分离技术与光学检测器联用，使得液相色谱从最初的以分离目的为主，发展为可以同时完成分离分析

HPLC

第六页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一高效液相色谱适用于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和天然产物；合成和高分子化合物，以及无机和有机离子型化合物。在生命科学领域的应用

氨基酸、多肽、蛋白质，核碱、核苷、核苷酸、核酸（RNA、DNA）等生命物质的纯化和分析。药物分析

合成药物的纯化及质量控制，中草药有效成分的分离、制备及纯度测定以及临床医学的药代动力学研究中的分离分析。除聚合物外,约80%的药物都能用高效液相色谱进行分离和纯化。特别是手性药物的分离分析。第七页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一高效液相色谱法测定野蕨菜氨基酸成分

第八页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一

色谱条件：ShimpackCLCCN色谱柱，(150mm×6.0mm,5μm)，流动相：正己烷-乙醇-甲醇(87.8∶10.2∶2,V/V/V)；流速1.10mL·min-1；检测波长240nm；柱温40℃。

同时测定人血浆中地西泮、硝西泮、氯硝西泮、咪达唑仑、三唑仑、艾司唑仑和阿普唑仑7种药物的浓度第九页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一磺酸酯在HPLC上的手性分离第十页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一食品分析

①食品本身组成,特别是营养成分，如糖、有机酸、维生素、蛋白质、氨基酸、脂肪的分析；②食品添加剂，如防腐剂、抗氧化剂、合成色素、甜味剂和保鲜化学物质的分析；③食品污染物，如农药残余和黄曲霉素等的分析第十一页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一同时测定鳗鱼中磺胺嘧啶（ＳＤ）、磺胺甲基嘧啶（ＳＭ１）、磺胺二甲嘧啶（ＳＭ２）、磺胺甲氧嗪（ＳＭＰ）、磺胺甲噁唑（ＳＭＺ）、磺胺间甲氧嘧啶（ＳＭＲ）、磺胺间二甲氧嘧啶（ＳＤＭ）、磺胺喹噁啉（ＳＱＸ）8种磺胺类药物第十二页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第十三页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一环境监测

该法特别使用于分子量大,挥发性低、热稳定性差的有机污染物的分离和分析。如多环芳烃、酚类、多氯联苯、邻苯二甲酸酯类、联苯胺类、阴离子和非离子表面活性剂、有机农药等。第十四页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一图1十六种PAH标样的HPLC紫外谱图图2十六种PAH标样的HPLC荧光谱图以标准谱图相对照。图1和图2为十六种PAH标样在ZorbaxODS柱的HPLC图，出峰顺序为1.萘，2.苊烯，3.苊十芴，4.菲，5.蒽，6.荧蒽，7.芘，8.苯并(a)蒽十枹，9.苯并(b)荧蒽，10.苯并(k)荧蒽，11.苯并(a)芘，12.二苯并(a，h)蒽，13.苯并(ghi)苝，14.茚并(1,2,3-cd)芘。水质:多环芳烃的测定第十五页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一精细化工产品分析

具有较高分子量和较高沸点的有机化合物，如高碳数脂肪族或芳香族的醇、醛和酮、醚、酸、酯等化工原料，以及各种表面活性剂、药物、农药、染料、炸药等化工产品

制备分离应用

在许多科学研究和生产领域，往往需要制备或提取一些高纯化合物。

第十六页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第十七页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第十八页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第十九页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一色谱过程是一特殊的动态多次重复分离过程：从进样阀引入的样品组分被流动相带入色谱柱。由于不同组分与流动相和固定相的分子间作用力不同，它们在色谱柱的移动速度不同，先后流出色谱柱进入检测器。由检测器记录分离过程--色谱图。1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2．高压泵（输液泵）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置第二十页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一在线脱气机色谱泵及控制器进样器检测器数据处理及控制色谱柱第二十一页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一流动相脱气装置目的：使色谱泵的输液准确—脉动减少；保留时间及色谱峰面积重现性提高提高检测性能—防止气泡引起的尖峰；基线稳定保护色谱柱—减少死体积；防止填料的氧化惰性气体脱气法：向溶剂中吹入氦气等小分子气体，以使溶解在流动相中的空气等气体脱出。超声波脱气法：将溶剂瓶置于超声波清洗槽中，以水为介质超声脱气，一般500mL流动相超声20～30min。此法方便，不影响流动相的组成，适用于各种流动相脱气。抽真空：溶剂抽滤在线脱气：可保持连续脱气。第二十二页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。选择流动相时应注意的几个问题：第二十三页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一高压输液系统：一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。要求：泵体材料能耐化学腐蚀。能在高压下连续工作。通常要求耐压40～50MPa·cm-2。输出流量范围宽。一般为0.1～10mL/min。输出流量稳定，重复性高。流量控制的精密度应小于1%第二十四页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一高压泵要求：泵体材料能耐化学腐蚀。能在高压下连续工作。通常要求耐压40～50MPa·cm-2。

输出流量范围宽。一般为0.1～10mL/min。输出流量稳定，重复性高。流量控制的精密度应小于1%（动画1）第二十五页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）

第二十六页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一梯度洗脱梯度洗脱指采用两种（或多种）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续变化流动相组成比和极性的一种洗脱模式。对于复杂混合物，特别是保留性能相差较大的混合物的分离梯度洗脱是一种极为重要的手段。特点（1）改善分离,加快分析速度；

（2）改善峰形,减少拖尾,

有利于痕量组分的检测

第二十七页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一梯度洗脱第二十八页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一进样系统：不使整个压力变化的情况下将样品注入色谱柱高效液相色谱仪采用阀进样方式。分手动进样和自动进样

1）液相色谱进样针：平头，25、50和100μl等

2）阀进样（环路进样器）

进样量大小通过选择不同体积（1～100μl）的定量管决定。当进样阀手柄置于“取样（load）”位置时，用特制的平头注射器将样品液注入取样管。再将进样阀手柄转向“进样（inject）”位置时，流动相将样品掖携带进入色谱柱进行分离。3）自动进样器在程序控制器或计算机控制下可自动完成取样、进样、清洗等一系列操作，一次可进行几十个或上百个样品的分析。第二十九页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一（动画2）第三十页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一自动进样装置第三十一页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一分离系统：色谱柱

包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备柱内径较大，可达25mm以上。

操作注意：流动相的转换流速的变化幅度温度变化幅度专用色谱柱：样品及溶剂的要求有机——有机溶剂：直接转换有机——缓冲溶液：用纯水过渡记住：拿到一根新柱一定要先看使用说明第三十二页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一检测器：利用被测物的某一物理或化学性质与流动相有差异的原理，当被测物从色谱柱上流出时，会导致流动相背景值发生变化，从而在色谱图上以色谱峰形式表现出来。

几种主要检测器的基本特性第三十三页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一紫外吸收检测器（UV-VIS）

具有灵敏度高，线性范围宽，对流动相基本无响应，对流速和温度不敏感等特点，它是液相色谱最常用的检测器。固定波长型：光源波长固定，一般为254nm，简单、灵敏。可变波长型：常规氘灯（紫外光源）的使用范围195～400nm扫描型或二极管阵列：可以瞬间实现紫外可见光区的全波长扫描，得到时间－波长－吸收强度三维色谱图。样品池第三十四页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一紫外光度检测器光路图：（动画3）第三十五页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一

紫外检测的主要参数是选择检测波长

应考虑溶质和流动相的吸收特性：常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长，但为了选择性或其他目的也可适当牺牲灵敏度而选择吸收稍弱的波长；应尽可能选择检测波长下没有背景吸收的流动相第三十六页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。第三十七页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第三十八页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一示差折光检测器（refractiveindex，RX）除紫外检测器之外应用最多的检测器。通过连续监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定溶质浓度。折射率是物质的通用性质，示差折射检测器是一种通用型的整体性质检测器折射率对温度的变化非常灵敏，检测器必须恒温灵敏度较低，不能用于梯度洗脱。第三十九页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第四十页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一荧光检测器（fluorescencedetector，FLD）它用于检测物质本身具有荧光或为了提高灵敏度将无荧光的物质衍生成荧光体。可用荧光检测的物质：如某些代谢物、食品、药物、氨基酸、多肽、胺类、维生素、石油高沸点馏分、生物碱和甾族化合物等荧光检测器是一种很灵敏的,有选择性的检测器,其灵敏度比UV高10~1000倍,一般可测ppb级的化合物第四十一页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第四十二页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一电化学检测器（electrochemicaldetector，ECD）对于具有电活性的物质,在液相色谱中可采用电化学检测器检测。它包括电导库仑、安培、极谱、电位和光电导等形式；具有高选择性、高灵敏度、低造价等优点。第四十三页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一联用检测器液相色谱仪与质谱联用与红外光谱仪联用与核磁共振联用与原子吸收、原子发射光谱仪联用等

第四十四页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一工作站所有分析过程都可在线模拟显示，数据自动采集、处理和存储，并对整个分析实现自动控制。

Millennium32处理软件第四十五页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一一、按分离过程的物理化学原理分类

吸附色谱(AdsorptionChromatography)分配色谱（PartitionChromatography）离子交换色谱（IonExchangerChromatography）空间排阻色谱（SizeExclusionChromatography）亲合色谱（AffinityChromatography）二、按实际应用色谱类型分类

正相色谱与反相色谱离子对色谱离子交换色谱和离子色谱空间排阻色谱手性色谱电色谱等三、分离类型的选择第四十六页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一吸附色谱(AdsorptionChromatography)用固体吸附剂作固定相，以不同极性溶剂作流动相，样品中各组分依据它们在吸附剂上吸附力的大小来进行分离的色谱方法

流动相

活性吸附点

固定相

液固吸附色谱第四十七页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一分配色谱（PartitionChromatography）

用载带在固相基体上的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相，样品中各组分依据它们在固定液中溶解能力大小，即在固定相和流动相间的分配系数大小来进行分离的色谱方法。

液液分配色谱

第四十八页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一离子交换色谱

（IonExchangerChromatography）用离子交换剂作固定相，以具有一定pH值的缓冲溶液作流动相，样品中各离子组分依据它们与离子交换剂上荷电交换基团的交换能力大小来进行分离的色谱方法。

离子交换色谱

第四十九页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一空间排阻色谱（SizeExclusionChromatography）

用化学惰性多孔物质作固定相，样品中各组分依据它们在流动相的分子体积大小来进行分离的色谱方法。以水溶液作流动相的排阻色谱称为凝胶过滤色谱（GelFitrationChromatography）；以有机溶剂作流动相的排阻色谱称为凝胶渗透色谱（GelPermeationChromatography）。

排阻色谱第五十页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一亲合色谱（AffinityChromatography）

用固相基体上固载化生物特异性吸附的配位体作固定相，以具有一定pH值的缓冲溶液作流动相，样品中各生物活性分子组分依据它们与固相基体上固载的配位体之间的特异亲合力大小来进行分离的色谱方法

亲合色谱第五十一页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一正相色谱与反相色谱

正相色谱（NormalPhaseChromatography）

固定相的极性大于流动相的极性，适于分离油溶性或水溶性的极性和强极性化合物

。依据溶质分子的极性大小进行分离。溶质分子与固定相的极性基团产生特异的极性相互作用，极性作用大小决定的保留时间大小

反相色谱（ReversedPhaseChromatography）

固定相的极性小于流动相的极性，适于分离非极性、极性或离子型化合物，应用范围比正相广（约80％分析任务）。依据溶质分子的疏水性大小进行分离。溶质分子疏水基与疏水固定相产生非特异的疏水相互作用，疏水作用大小决定的保留时间大小。反相色谱中常用含水乙腈、甲醇和四氢呋喃的流动相。第五十二页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一离子对色谱

离子抑制技术

降低流动相的酸度，离解增大，造成保留降低；增大流动相的酸度，抑制弱酸离解，保留时间增大。调节流动相的pH大小，抑制离子离解，可使弱酸或弱碱的有机物在反相柱上得到较好的保留反相离子对色谱流动相添加"离子对试剂"，使得难保留的样品离子与离子对试剂形成中性离子对缔合物，增加它们在反相柱上的保留能力。不同的样品离子,形成离子对的能力不同，导致它们在色谱柱的保留时间不同。大多数可离解的化合物在液固色谱分离时，强烈的吸附在硅醇基上,造成保留时间太大,甚至不能流出色谱柱,或者严重拖尾,柱效很低。同样，离子型化合物在反相色谱中也难于保留。采用离子抑制技术或离子对色谱方法可对它们进行分离分析。通常应用于酸和碱混合物的分离及金属螯合物的分离。第五十三页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一离子色谱离子交换色谱离子交换色谱是一种以离子交换剂为固定相，用来分离分析阳离子和阴离子的液相色谱法，其分离原理是溶质离子和流动相中的抗衡离子间与离子交换剂上的固定离子点位的亲合竞争。

凡是在溶液中能够电离的物质，通常都能用离子交换色谱进行分离，它不仅适用于无机离子混合物的分离，也可用于有机物的分离，特别是氨基酸、核酸、蛋白质等生物物质的分析。一般采用含盐的水溶液作流动相，流动相选择应满足：能够溶解各种盐并提供离子交换必需的缓冲液具有合适的离子强度以便控制样品离子的保留值对被分离的对象有选择性第五十四页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一

空间排阻色谱

(SizeExclusionChromatography,SEC)根据溶质分子尺寸(分子量、有效体积、流体力学体积)的差别进行分离的。排阻色谱的应用范围广泛，特别是在生物化学和材料科学领域,可用于分离那些因溶解度、极性吸附或离子特性无足够差异的,分子量在10~106这样一个宽范围的大分子混合物排阻色谱（凝胶色谱）：凝胶渗透色谱(GPC)：以有机溶剂为流动相凝胶过滤色谱(GFC)：以水为流动相的凝胶色谱第五十五页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一手性色谱手性化合物在生命科学中占有十分重要的位置，特别是在生物化学，药物化学等领域中尤为突出，医药工业中约有30%～40%药物是具有手性的。手性色谱是分离分析手性化合物的重要方法。第五十六页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一毛细管电色谱

(CapillaryElectrochromatography,CEC)

毛细管电色谱通常指以电渗流代替压力流推动流动相的毛细管柱高效液相色谱。毛细管电色谱一般采用熔融的50~100μm的石英毛细管柱，柱内填充1~3μm

的HPLC固定相，在毛细管电泳仪实现分离检测。第五十七页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一亲合色谱

AffinityChromatography亲合色谱指用固相基体上固载化生物特异性吸附的配位体作固定相，以具有一定pH值的缓冲溶液作流动相，样品中各生物活性分子组分依据它们与固相基体上固载的配位体之间的特异亲合力大小来进行分离的色谱方法。第五十八页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一分离类型的选择根据相对分子质量选择相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱。标准液相色谱类型（液一固、液一液、及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是200～2000。对于相对分子质量大于2000的样品，则用尺寸排阻法为最佳。根据溶解度选择弄清样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙醇中的溶解度。如果样品可溶于水并属于能离解物质，以采用离子交换色谱为佳。如样品可溶于烃类（如苯或异辛烷），则可采用液一固吸附色谱；如样品溶解于四氯化碳，则多采用常规的分配和吸附色谱分离；如样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液一液分配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。第五十九页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一根据分子结构选择用红外光谱法，可预先简单地判断样品中存在什么官能团。然后，确定采用什么方法合适。例如，酸、碱化合物用离子交换色谱；脂肪族或芳香族用液一液分配色谱、液一固吸附色谱；异构体用液一固吸附色谱；同系物不同官能团及强氢键的用液一液分配色谱。

现列出下表作为选择分离类型的参考。第六十页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一液相色谱分离类型选择参考表

溶于水——排阻色谱，水为流动相相对分子质量＞2000

不溶于水——排阻色谱，非水流动相同系物——分配色谱不溶于水异构体——吸附色谱样品分子大小差异——排阻色谱反相液一液色谱相对分子质量溶于水，不离解＜2000

排阻色谱，水为流动相碱——阳离子交换色谱溶于水，可离解酸——阴离子交换色谱溶于水，离子与非离子—反相离子对色谱第六十一页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第六十二页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一HPLC分析方法建立的一般过程HPLC定性、定量分析HPLC基本实验技术第六十三页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第六十四页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一首先要查文献资料,包括仪器厂商的应用资料,了解他人的工作,找出你需要的参考条件。若手头没有合适的参考资料,则可根据分子分子量大小、在水中和有机溶剂中的溶解度、化学结构、极性和稳定性等物理化学性质确定分离模式,选择主要的色谱条件：色谱柱、流动相组成和检测器类型。评价液相色谱柱系统选择的二个标准：

①有满意的分离度

②有合适的保留值范围。第六十五页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一定性分析利用保留值定性

对照保留值：在确定的色谱条件下(色谱柱、流动相组成、柱温等),对照被测化合物与标准样的保留时间。标准加入：对照样品和加标样品的峰高变化确定被测化合物的色谱峰位置利用检测器的选择性定性（联用技术）

采用全波长扫描吸收检测器：对照被测化合物与标准物的保留值和光谱图。

采用质谱检测器：对照被测化合物与标准物的保留值和质谱图。离线结构分析：收集柱后流出的纯组分，进行结构分析

第六十六页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第六十七页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第六十八页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第六十九页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第七十页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第七十一页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第七十二页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第七十三页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第七十四页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第七十五页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第七十六页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第七十七页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第七十八页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第七十九页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第八十页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第八十一页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第八十二页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第八十三页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第八十四页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第八十五页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第八十六页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一二.噪音N,漂移M,检测限D是否灵敏度放大到越高越好?检测限D(也叫敏感度)定义:为检测器二倍噪声的水平

噪音N,漂移M

D=2N/SS↑N↓D越小越敏感因此性能好的Det,不但灵敏度高而且噪声要小组分在Det中的信号必须大于Det本底信号(噪声)才能与噪声区别，规定:组分信号至少为噪声的二倍,才可定量。第八十七页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一三.最小检测量mminmmin定义:产生色谱峰高等于二倍噪声(2N)时的进样量

∵进样量为m时,洗出峰高为h,记录仪灵敏度u1m:hu1=mmin:2N∴mmin=mN/hu1=mDSc/hu1

∵Sc=u1FdA/u2mA=1.065*W1/2*h(1)对浓度型Detmmin=(1.065Fd/u2)*W1/2*D(2)对质量型Detmmin=(1.065*60/u2)*W1/2*D第八十八页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一四.最小检测浓度指一定进样量m时,GC分析所能检测出的最低浓度Cmin=mmin/

V

mg/LV--进样体积五.线形范围R∝C

定义:信号与进样量成正比的数量范围即最大允许进样量与最小允许进样量之比线形范围宽:

表示不管是含量高的组分或是微量组分都能准确定量第八十九页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一样品制备样品的溶解

用于溶解分析样品的溶剂应与液相色谱流动相互溶，最好选用流动相来溶解或提取被分析样品的待测组分，这样可以避免溶剂峰的干扰。

制备好的分析试液应为均相溶液，无不溶物，否则在进行色谱分析之前应进行0.45μm或0.2μm微孔膜过滤。目的是使样品与所使用的HPLC方法相兼容，即把分析样品中的待测组分转化为适合HPLC直接进样分析的试液。第九十页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一样品前处理

a.过滤和离心：对于基体复杂的样品液，不溶物可以通过过滤或高速离心除去。有时加入合适沉淀剂或改变溶剂，使大分子基质以沉淀方式除去。

b.液液萃取：水样中的待测有机化合物通过液液萃取到有机相后进行液相色谱分析

c.固相萃取（SolidPhaseExtraction,SPE）：利用选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱分离原理，使液体样品通过一吸附剂小柱，保留其中某些组分，再选用适当的溶剂冲洗杂质，然后用少量溶剂迅速洗脱，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。

第九十一页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一流动相的配制配制：对于二元溶剂或多元溶剂等度洗脱，液相色谱流动相通常均按溶剂体积比配制。要求溶剂必须互溶过滤：HPLC流动相使用前要用0.45m微孔膜过滤

溶于流动相的空气会影响液相色谱系统的操作性能。如气泡进入泵腔将使高压泵流速不稳；而流动相通过柱子时其中的气泡受到压力而压缩，流出柱子到检测器时，会因为压力降至常压而将气泡释放出来，造成检测器噪声增大，基线不稳。第九十二页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第九十三页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第九十四页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一第九十五页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一Waters

600E型HPLC操作规程

一.冲洗流路1.开脱气机电源,开泵控制器电源。2.按“Setup”功能键,设定压力范围。3.按“Direct”,键,设定流速和溶剂组成。4.开清洗阀,从多通阀抽出残余的溶剂。5.降流速,关清洗阀,升流速,平衡色谱系统二.系统配置1.开检测器电源。开微机电源。2.双击Millennium图标,进入软件。3.双击Configure

system图标,击Acquisition、0K。击Acquisition

severs的“+”号,击仪器系统名。4.击File菜单,选Exit。5.双击Browse

Project图标,选合适的项目名、0K。6.击QuickSet工具。第九十六页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一三.设置仪器方法1.击Instrument

Method中的Edit按钮。2.在Instruments树下,击600泵,输入压力上下限,再输入流速和溶剂比例。3.在Instruments树下,击2487检测器,设置起止波长4.选Fi1e、Save

as,输入仪器方法名,击Save按钮。5.选File、Exit。

6.在QuickSet的仪器方法下的下拉菜单中选一个仪器方法7.击Monitor,观察基线情况。

第九十七页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一四.运行色谱1.击Run工具,准确抽取标样或样品。2.将进样针插入进样孔,将进样阀柄向上扳到Load位置3.注入溶液,再将阀柄向下扳到Iniect位置,拔出进样针。五.色谱数据处理1.一次运行结束后,在Project的Channel中击待处理样品名2.击Review工具,在3D下切取某波长的色谱。3.击处理方法向导。4.设置峰宽、临界值、积分区间、最小峰面积(或峰高)5.输入组分名称和浓度。6.击积分工具。7.选File、Save、Resuit。

第九十八页，共一百零五页，编辑于2023年，星期一六.打印色谱报告1.在Proiect中选Results标签,再选其中的样品名。2.击预览工具